本研究由Umberto M. Battisti、Rocío García-Vázquez、Dennis Svatunek、Barbara Herrmann、Andreas Löffler、Hannes Mikula以及Matthias Manfred Herth等人完成，发表于 Bioconjugate Chemistry 期刊2022年第33卷第608至624页。该研究聚焦于生物正交化学领域中四嗪（tetrazines，Tz）与反式环辛烯（trans-cyclooctene，TCO）之间的逆电子需求Diels-Alder（inverse electron-demand Diels-Alder，IEDDA）反应，系统考察了取代芳基四嗪结构中苯环取代模式对反应动力学的影响。
生物正交反应是指在生物体系中不存在、且不与生物功能基团发生干扰的化学转化。自Bertozzi提出该概念以来，生物正交化学已在生物医学研究、药物递送、分子成像及放射性化学等领域获得广泛应用。在众多生物正交反应中，1,2,4,5-四嗪与反式环辛烯之间的[4+2]环加成反应因其卓越的反应动力学而备受关注，该反应具有高选择性、与生物体系的良好兼容性，甚至能够在活体内应用。
四嗪连接反应在预靶向正电子发射断层扫描（positron emission tomography，PET）成像中具有重要应用价值。由于体内放射性标记化合物浓度极低，预靶向策略要求极高的反应速率常数。氟-18（¹⁸F）因其近乎理想的物理特性被视为分子成像的优选核素，然而四嗪核心在传统直接¹⁸F氟化所需的碱性条件下不稳定，长期以来未能实现¹⁸F标记四嗪的合成。研究团队此前报道了首例采用铜介导氧化[¹⁸F]氟化方法直接标记高反应活性四嗪的策略，开发出以3-(3-氟苯基)-1,2,4,5-四嗪为核心骨架的亲水性、快速清除型生物正交点击成像剂（化合物1）。
尽管已知吸电子取代基提高反应活性、给电子取代基降低反应活性的总体规律，但关于四嗪衍生物苯环上不同取代基对反应动力学影响的系统性研究仍很有限。大多数已有研究集中于四嗪核心本身的取代基效应，而非苯环上的取代模式。因此，本研究旨在系统制备一个包含40种四嗪衍生物的化合物库，涵盖16种不同的苯环取代基和4位、5位、6位三种取代位置异构体，在乙腈（CH₃CN）和Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）中分别测定其与TCO的IEDDA反应速率，以揭示取代模式与反应活性之间的关系，建立反应活性预测方法，促进下一代取代芳基四嗪的合理设计。
研究设计了16种不同的取代基修饰的3-(3-氟苯基)-1,2,4,5-四嗪衍生物，取代基覆盖了吸电子基团、给电子基团和具有空间位阻效应的基团，同时考察了取代基位于苯环4位（a系列，相对于四嗪为对位）、5位（b系列，相对于四嗪为间位）和6位（c系列，相对于四嗪为邻位）三种异构体。
四嗪衍生物2a–c、3a–c和5–10a–c所需的前体腈类化合物可直接购得。对于四嗪4a–c的合成，首先将相应的溴苄化合物与邻苯二甲酰亚胺钾盐反应，再经肼解脱保护得到伯胺，随后与二叔丁基二碳酸酯反应得到Boc保护的氨基甲基苯甲腈前体。四嗪12a–c的叔丁酯腈前体由相应羧酸制备；四嗪13a–c的伯酰胺和14a–c的仲酰胺前体则通过CDI介导的羧基活化后与氨或甲胺反应获得，收率76%至80%。四嗪15a–c和16a–c的前体分别通过对相应苯胺进行Boc保护或酰化获得。磺酰胺类四嗪17a–c的前体通过改良的Sandmeyer法及随后的氨反应制备。
四嗪核心的构建采用Qu等人报道的无金属合成策略：以腈为起始原料，在硫和乙醇存在下与肼反应形成中间体，再经亚硝酸氧化得到四嗪。4位和5位取代衍生物以此法以中等收率获得；6位取代衍生物的制备更为困难，仅2c及4c–9c可成功获得，提示6位的大体积基团可能阻碍反应或生成高度不稳定的四嗪。Boc保护的四嗪经盐酸脱保护得到氨基甲基取代四嗪4a–c、15a和15b，收率46%至97%。甲酯11a和11b由相应羧酸经酸催化酯化制备，收率分别为85%和66%。
四嗪与TCO的反应速率采用停流分光光度法（stopped-flow spectrophotometry）在两种介质中测定：在乙腈中于25°C下使用无水TCO，在DPBS中于37°C下使用AxTCO-PEG₄。通过拟一级反应条件测定各四嗪的二级反应速率常数。表1汇总了所有可获得化合物的速率常数数据。
研究采用ωB97X-D/def2-TZVPD水平的密度泛函理论（density functional theory，DFT）计算方法，对22种四嗪（2–9a、2–9b、2c及5–9c）与TCO的反应势垒进行了详细计算。分别在气相条件下和引入SMD隐式溶剂模型（水）的条件下计算反应能垒，并将其与实验测定的速率常数进行相关性分析。此外，计算了四嗪的最低未占分子轨道+1（LUMO+1）能级，以评估前沿分子轨道（frontier molecular orbital，FMO）控制对反应活性的贡献。酚类化合物8a–c的pKₐ值采用Shields等人开发的计算方法估算。
与乙腈相比，水溶液中测得的速率常数高出约两个数量级，这是Diels-Alder反应中氢键形成能力的典型表现。更重要的是，乙腈中测得的速率常数与DPBS中的结果相关性较差（R² = 0.83，需排除质子化状态不同的化合物）。这一差异主要源于部分四嗪在两种溶剂中的质子化状态不同：羧酸类化合物10a和10b在乙腈中以质子化形式存在，但在pH 7.4的DPBS中去质子化；胺类化合物4a在乙腈中为盐酸盐质子化形式，而在生理pH下主要为中性状态。计算得到的酚类8a的pKₐ为7.8，表明其在缓冲溶液中部分去质子化，去质子化后由吸电子基团转变为给电子基团，导致水溶液中反应活性降低。这一发现强调了在模拟生物应用条件的水性、pH受控溶液中进行动力学测量的必要性。
DPBS中测得的二级速率常数范围为约20,000至130,000 M⁻¹s⁻¹。4位取代衍生物为20,000至130,000 M⁻¹s⁻¹，5位取代化合物为70,000至110,000 M⁻¹s⁻¹，6位取代四嗪速率较低，为25,000至80,000 M⁻¹s⁻¹。在大多数情况下，5位取代衍生物的反应活性高于相应的4位异构体，6位化合物活性最低。例外的是8a–c系列，8a由于去质子化而显示最低反应活性。大多数取代基通过共振效应影响π体系的电子密度，这种共轭效应在邻位和对位最强，解释了a系列（对位取代）相对于b系列（间位取代）具有更强的反应活性影响和更大的变异性。
4位取代四嗪的反应活性与Hammett σₘ参数呈现良好的相关性（图3a），证明该系列化合物的反应活性主要由前沿分子轨道控制。然而，5位和6位取代苯基四嗪的反应速率与Hammett常数相关性不佳（图3b、3c），因为该模型仅考虑单一取代基的孤立影响，未考虑苯环上氟取代的叠加效应。
对6位取代四嗪，将速率常数对Charton立体参数υ作图显示，空间位阻越大的取代基导致反应速率越低（图3d）。然而，气相DFT计算揭示了一个反常现象：6位取代衍生物的气相反应势垒出乎意料地低于（即固有反应活性高于）相应的4位和5位异构体。这一高固有反应活性归因于“畸变降低效应”：由于取代基的存在，两个芳香体系在反应物中不共面，降低了将四嗪推至过渡态构型所需的能量代价。
气相计算结果与实验速率常数无相关性（图4a），而引入SMD水溶剂模型后获得良好相关性（图4b）。这一差异揭示了重要的溶剂效应：4位和5位取代四嗪在水溶剂模型中的平均反应势垒降低为3.7 kcal/mol（范围3.4–4.2 kcal/mol），而6位取代四嗪的平均稳定化仅为1.8 kcal/mol（范围0.9–3.4 kcal/mol）。在决速步骤中形成极化过渡态，极性溶剂和氢键可稳定该过渡态从而降低势垒，但6位取代基部分阻断了溶剂接近过渡态极化部位的通路，导致溶剂稳定化效果减弱。取代基体积越大，溶剂可及性越低，形成了二级速率常数与空间参数之间的相关性。
对于4位取代苯基四嗪，反应活性完全由前沿分子轨道控制。ωB97X-D/def2-TZVPD-SMD（水）计算的LUMO+1能级与计算势垒之间呈现优异的相关性（图5a），说明仅需计算轨道能级即可估测该类四嗪的反应活性。然而对于5位和6位取代化合物，其他效应开始介入，FMO相互作用不再足以指示反应活性（图5b、5c），必须进行反应势垒的完整计算才能正确预测反应活性。
本研究系统地揭示了取代氟代芳基四嗪生物正交反应性的关键影响因素。动力学研究证明了反应活性在不同溶剂中存在显著差异，特别是离子型化合物的相对活性在乙腈和DPBS之间变化更大，凸显了在水性溶液中进行动力学测量的重要性。苯环上取代模式对四嗪骨架的反应活性具有决定性作用：4位取代苯基四嗪的反应活性主要由前沿分子轨道控制，可通过Hammett σₘ参数简便预测；5位取代类似物的反应活性可通过气相DFT计算较好地解释；而6位取代异构体则必须在计算中考虑溶剂效应。研究揭示6位取代基通过阻断溶剂对极化过渡态的稳定化作用来降低反应活性，这一机制性理解为四嗪结构设计提供了新的理论依据。
考虑到近期放射性标记¹⁸F-苯基四嗪的开发进展及其在体内预靶向成像中的生物正交性能改进，本研究的结果将为下一代体内预靶向用四嗪的设计提供有力指导。该研究的科学价值在于建立了四嗪取代模式-反应活性关系的系统理解框架，应用价值则体现在为PET成像预靶向策略中四嗪成像剂的合理设计提供了可操作的预测工具。