本文属于类型a，即单一原创研究报告。

本研究由九州大学医学科学研究院病态机能内科学的shibahara tomoya（柴原智哉）、ago tetsuro（吾郷哲朗）、nakamura kuniyuki（中村邦之）、tachibana masaki（橘正樹）、yoshikawa yoji（吉川陽治）、komori motohiro（小森元宏）、yamanaka kei（山中慶）、wakisaka yoshinobu（脇坂佳信）及kitazono takanari（北園孝成）共同完成，于2020年2月5日首次发表于 eneuro 期刊，文章编号为eneuro.0474-19.2020，doi为10.1523/eneuro.0474-19.2020。

本研究属于脑血管病与神经修复领域。缺血性脑卒中后，梗死区内的纤维化修复主要由表达血小板源性生长因子受体β（pdgfrb）的周细胞介导，但长期以来，关于这种纤维化修复究竟有益于还是有害于卒中后的功能恢复，学术界一直存在争议。已有研究表明，卒中后梗死周围区域可发生星形胶质细胞增生、少突胶质细胞新生及髓鞘再生等神经重塑过程，这些过程与自发性功能恢复密切相关。然而，梗死区内的纤维化修复与梗死周围神经重塑之间的联系尚不清楚。因此，本研究旨在利用周细胞功能缺陷的pdgfrb杂合敲除（pdgfrb+/–）小鼠，阐明周细胞介导的梗死区内组织修复是否以及如何影响梗死周围神经重塑和急性缺血性卒中后的功能恢复。

在研究方法上，本研究采用了多种技术手段，构建了系统的实验流程。首先，研究者对野生型和pdgfrb+/–小鼠实施永久性大脑中动脉闭塞（pmcao）模型，通过免疫印迹分析确认pdgfrb+/–小鼠脑内pdgfrb蛋白表达量较野生型降低约80%，且生理参数如收缩压、舒张压和心率在两组间无显著差异。其次，通过map2免疫组化染色评估不同时间点（第1、7、14、28天）的梗死面积、梗死体积和组织萎缩程度；利用激光散斑血流成像技术检测缺血区脑血流恢复情况；通过乳胶灌注法和皮层全标本免疫染色评估软脑膜吻合动脉的直径和数量，并结合cd31和αsma染色观察吻合处平滑肌细胞的聚集。第三，运用免疫组化和免疫荧光技术检测梗死区内pdgfrb、cd13、cd31、纤维蛋白等表达，评估梗死区内纤维化形成、血脑屏障破坏及血管新生情况；同时通过定量pcr检测缺血半球内多种基因的mrna表达水平。第四，采用gfap、iba1、pstat3等标记物检测梗死周围星形胶质细胞增生及stat3磷酸化水平；通过体外培养人脑周细胞和原代星形胶质细胞，制备周细胞条件培养基（pcm），并分别用pbs或pdgf-bb处理周细胞以获得pcm/pbs或pcm/pdgf-bb，再将这些条件培养基作用于培养的星形胶质细胞，采用mts增殖实验、edu增殖实验、划痕实验和免疫印迹分析评估星形胶质细胞的增殖、迁移及stat3、akt、erk信号通路的变化。第五，采用dcx、neun、edu、olig2、apc、gstp、mbp和smi312等标记物评估梗死周围神经元新生、少突胶质前体细胞增殖、少突胶质细胞分化、新生髓鞘形成及轴突髓鞘化程度。第六，通过体外培养原代少突胶质前体细胞（opcs），将其与星形胶质细胞条件培养基（acm）或经pcm预处理的星形胶质细胞条件培养基（p-acm/pbs或p-acm/pdgf-bb）共孵育，运用定量pcr和免疫荧光检测mbp、mag、plp等髓鞘相关基因表达及mbp阳性细胞比例。最后，利用转棒实验、改良神经功能缺损评分（mnss）和圆筒实验评估小鼠在术后第1、3、7、14、21、28天的感觉运动功能恢复情况。所有数据采用student’s t检验或单因素方差分析（anova）及bonferroni事后检验进行统计分析，样本量在每组5至12只小鼠之间。

研究结果系统地揭示了pdgfrb介导的周细胞修复对卒中后恢复的多方面促进作用。首先，在梗死体积变化方面，第1天时野生型和pdgfrb+/–小鼠的map2阴性面积无统计学差异，但从第7天至第28天，pdgfrb+/–小鼠的map2阴性面积和最终梗死体积均显著大于野生型小鼠，组织萎缩也更为严重（p < 0.05），提示pdgfrb信号参与了梗死区修复性收缩过程。其次，在脑血流恢复方面，尽管术后第1天两组缺血区相对脑血流减少程度相似（约47% vs 46%），但pdgfrb+/–小鼠在第7天至第28天的血流恢复显著受损。软脑膜吻合动脉直径在野生型小鼠中显著增大（从约20.8 μm增至46.6 μm），而pdgfrb+/–小鼠仅增至35.4 μm；吻合处αsma阳性平滑肌细胞聚集减少，缺血半球内ccl2和tnfα的mrna水平也显著降低。体外实验证实pdgf-bb可通过pdgfrb刺激血管平滑肌细胞上调ccl2和tnfα，从而促进单核/巨噬细胞募集和动脉生成。第三，梗死区内cd13阳性纤维化区域在pdgfrb+/–小鼠中显著减少，第14天和第28天差异均有统计学意义（p < 0.01）；同时，纤维蛋白渗出和伊文思蓝染料渗漏在pdgfrb+/–小鼠中更明显，cd31阳性微血管密度也更低，说明pdgfrb参与梗死区内血管新生并有助于血脑屏障修复。第四，peri-梗死区星形胶质细胞增生在pdgfrb+/–小鼠中显著减弱，伴随stat3磷酸化水平下降。体外实验表明，pcm可增强星形胶质细胞的增殖和迁移，pcm/pdgf-bb进一步增强了这些效应，且stat3和akt磷酸化水平升高。体内实验显示，梗死区内ng2阳性周细胞表达il-6，pdgfrb+/–小鼠梗死区il-6 mrna水平显著降低；pdgf-bb可在体外通过pdgfrb上调周细胞il-6表达，而抗il-6中和抗体可剂量依赖性地抑制pcm对星形胶质细胞的促增殖作用，提示il-6在周细胞-星形胶质细胞相互作用中发挥部分作用。第五，在神经新生方面，dcx阳性未成熟神经元的迁移和neun/edu双阳性新生神经元数量在两组间无显著差异，说明pdgfrb修复不直接影响神经元新生。然而，在少突胶质细胞新生方面，尽管olig2阳性前体细胞在两组中均在卒中后显著增加且无组间差异，但apc阳性成熟少突胶质细胞数量和gstp/edu双阳性新生少突胶质细胞数量在pdgfrb+/–小鼠中均显著减少，mbp/smi312比值也显著降低，表明髓鞘再生受到抑制。体外实验进一步显示，p-acm/pdgf-bb能最大程度地促进opcs的mbp、mag和plp mrna表达以及mbp阳性细胞数量，而直接应用pcm对opcs的分化促进作用远弱于acm，说明星形胶质细胞是周细胞信号作用于opcs的关键中间环节。pcm还可上调星形胶质细胞中gfap、ctnnb1、bdnf和igf1的表达。最终，行为学结果表明，术后第1至第3天两组功能缺损程度相当，但从第14天开始，pdgfrb+/–小鼠的转棒、mnss和圆筒实验均显示出显著更差的功能恢复，且这种差异持续至第28天。

综合上述结果，本研究得出了明确的结论：周细胞通过pdgfrb介导的梗死区内纤维化修复可促进缺血区脑血流恢复、增强梗死周围星形胶质细胞增生和少突胶质细胞新生及髓鞘再生，最终促进急性缺血性卒中后的功能恢复。其机制涉及pdgfrb阳性周细胞通过分泌il-6等因子激活星形胶质细胞stat3通路，活化的星形胶质细胞进一步产生bdnf、igf1等营养因子，促进局部少突胶质前体细胞向成熟少突胶质细胞分化并形成髓鞘。这一发现具有重要的科学意义和临床转化价值：一方面，它阐明了长期以来关于卒中后纤维化修复利弊争议的机制，即周细胞驱动的修复并非单纯的疤痕隔离，而是主动参与神经重塑的支持过程；另一方面，它提示pdgfrb信号通路及其下游的周细胞-星形胶质细胞-少突胶质前体细胞互作网络可能成为促进卒中后功能恢复的新治疗靶点。

本研究的亮点在于：第一，首次系统性地将梗死区内周细胞介导的纤维化修复与梗死周围星形胶质细胞增生和少突胶质细胞新生过程联系起来，并证明纤维化修复对功能恢复具有积极作用；第二，通过体内外结合的方法，揭示了周细胞-星形胶质细胞-少突胶质前体细胞三级细胞互作机制，其中il-6/stat3信号是关键环节；第三，采用pdgfrb杂合敲除小鼠模型规避了纯合敲除的胚胎致死问题，同时保留约20%的pdgfrb表达，为研究卒中后周细胞功能提供了可行的动物模型；第四，实验设计覆盖了从分子信号、细胞行为、组织重塑到整体功能的多层次分析，证据链完整且逻辑清晰。此外，该研究还排除了pdgfrb修复对神经元新生的直接影响，进一步聚焦于少突胶质细胞新生和髓鞘再生作为功能恢复的关键细胞机制，为后续精准干预策略的开发指明了方向。