《Wnt/β-catenin/CYP1B1通路激活减轻脑缺血/再灌注条件下的氧化应激并保护血脑屏障》研究报告

作者与发表信息

本研究由Xingyong Chen（第一作者，福建医科大学附属福建省立医院神经内科）、Nannan Yao、Yanguang Mao等共同完成，通讯作者为Yinzhou Wang（福建省医学科学院）和Xu Zhang（福建省立医院）。研究发表于Neural Regeneration Research（2024年7月，第19卷第7期），DOI: 10.⁴¹⁰³⁄₁₆₇₃-5374.386398。

学术背景

研究领域：缺血性卒中（ischemic stroke）后血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）损伤的分子机制及治疗靶点。
科学问题：缺血性卒中后，氧化应激（oxidative stress, OS）与Wnt/β-catenin信号通路抑制如何共同导致BBB破坏，而CYP1B1（细胞色素P450 1B1）是否作为该通路的下游靶点参与调控？
研究动机：既往研究表明，OS和Wnt/β-catenin通路在卒中后BBB损伤中起关键作用，但二者间的交互机制及CYP1B1的作用尚不明确。
研究目标：
1. 验证Wnt/β-catenin/CYP1B1通路在脑缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）中的调控作用；
2. 阐明该通路通过减轻OS和维持紧密连接（tight junction, TJ）蛋白保护BBB的机制。

研究流程与方法

1. 动物模型与药物干预

• 研究对象：雄性Sprague-Dawley大鼠（n=8/组），分为假手术组、MCAO（大脑中动脉闭塞）模型组、TWS119（GSK-3β抑制剂）治疗组。
  
• 关键操作：
  
  • 通过线栓法建立MCAO模型，缺血1小时后再灌注72小时；
    
  • TWS119（30 mg/kg）腹腔注射，激活Wnt/β-catenin通路。
    
• 检测指标：
  
  • Western blot分析GSK-3β磷酸化、β-catenin、Wnt-3a、CYP1B1及TJ蛋白（ZO-1、occludin、claudin-5）；
    
  • 免疫荧光染色观察CD31（血管内皮标记物）和ROS（活性氧）水平。
    

2. 细胞实验与基因调控

• 研究对象：大鼠脑微血管内皮细胞（RBMVECs），建立氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型模拟缺血损伤。
  
• 基因操作：
  
  • 过表达β-catenin：通过慢病毒转染；
    
  • 基因沉默：siRNA靶向β-catenin或CYP1B1。
    
• 功能实验：
  
  • 划痕实验检测细胞迁移能力；
    
  • DHE荧光染色定量ROS；
    
  • 凋亡相关蛋白（Bcl2、Bax、cleaved caspase-3）检测。
    

3. 数据分析

• 使用SPSS 19和GraphPad Prism 9进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）或t检验，显著性阈值设为*p<0.05*。
  

主要结果

1. TWS119激活Wnt/β-catenin通路并减轻氧化应激

• 体内实验：MCAO大鼠的β-catenin和Wnt-3a蛋白水平显著降低，而TWS119治疗可逆转这一趋势（*p<0.001*），同时降低NOX4和p22-phox（氧化应激标志物），升高SOD1（抗氧化酶）。
  
• BBB保护：TWS119组TJ蛋白（ZO-1、occludin、claudin-5）和CYP1B1表达显著恢复，CD31阳性微血管密度增加。
  

2. OGD/R抑制Wnt/β-catenin通路并下调CYP1B1

• 细胞模型：OGD/R导致RBMVECs中β-catenin和CYP1B1蛋白随时间递减（最低点：再氧合24-48小时），伴随ROS爆发和TJ蛋白降解。
  
• 基因干预效果：
  
  • β-catenin过表达：减少ROS生成，抑制细胞凋亡，促进迁移（划痕愈合率提高*~40%*）；
    
  • CYP1B1沉默：加剧OS和TJ蛋白丢失，且不影响β-catenin表达，证实CYP1B1为下游靶点。
    

3. 通路调控机制

• Wnt/β-catenin→CYP1B1单向调控：β-catenin siRNA降低CYP1B1，但CYP1B1 siRNA不改变β-catenin、GSK-3β或Wnt-3a水平。
  

结论与意义

1. 科学价值：
   
   • 首次揭示Wnt/β-catenin/CYP1B1轴在卒中后BBB保护中的核心作用，阐明CYP1B1作为该通路下游效应分子的机制。
     
   • 为卒中治疗提供新靶点：通过药物（如TWS119）或基因调控激活该通路，可同时减轻OS和维持BBB完整性。
     
2. 应用潜力：
   
   • 针对CYP1B1的抗氧化疗法或可弥补当前抗氧化药物临床转化失败的局限性。
     

研究亮点

1. 创新性发现：
   
   • 明确CYP1B1受Wnt/β-catenin转录调控，且独立于经典反馈回路；
     
   • 揭示β-catenin过表达通过上调CYP1B1增强内皮细胞抗OS能力的直接证据。
     
2. 方法学优势：
   
   • 结合体内（MCAO）和体外（OGD/R）模型，多维度验证通路机制；
     
   • 采用siRNA和慢病毒转染技术精准调控基因表达。
     

局限性与展望

1. 未解决的问题：
   
   • CYP1B1启动子区域与β-catenin的结合位点需通过染色质免疫共沉淀（ChIP）进一步验证；
     
   • 缺乏CYP1B1基因敲除动物的在体实验数据。
     
2. 未来方向：
   
   • 探索Wnt/β-catenin/CYP1B1与其他通路（如HIF-1α）的交互作用；
     
   • 开发靶向CYP1B1的小分子激动剂。
     

总结：本研究通过多层次实验设计，系统解析了Wnt/β-catenin/CYP1B1通路在卒中后BBB保护中的关键角色，为临床干预策略提供了理论依据。