本研究由首都医科大学附属北京安贞医院麻醉科的Zhaoqi Wang、Duomao Lin、Boqun Cui、Dongni Zhang、Jinjing Wu以及通讯作者Jun Ma共同完成，相关论文发表于*European Journal of Pharmacology*第963卷，文章编号176292，于2023年12月19日在线发表。该研究属于心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury, I/R injury）的基础医学研究领域，旨在探索褪黑素（melatonin）在心肌缺血再灌注损伤中的保护机制，尤其是其通过Apelin/Sirt3信号轴抑制过度线粒体自噬（mitophagy）的作用。
心肌缺血再灌注损伤是急性心肌梗死再灌注治疗中常见的并发症，其病理机制涉及活性氧（reactive oxygen species, ROS）过度产生、线粒体功能障碍以及不受控制的线粒体自噬。线粒体自噬是细胞清除受损线粒体的选择性自噬过程，在缺血再灌注早期具有保护作用，但过度激活的线粒体自噬可导致健康线粒体的大量损耗，进而引起ATP供应不足和心肌细胞死亡。褪黑素作为一种由松果体分泌的神经内分泌激素，已被证实可通过抗氧化、抗炎和改善线粒体功能等途径减轻心肌缺血再灌注损伤。然而，褪黑素调节线粒体自噬的具体分子机制尚未完全阐明。本研究假设褪黑素通过上调Apelin及其下游Sirt3信号通路，抑制缺血再灌注诱导的过度线粒体自噬，从而发挥心肌保护作用。
为验证上述假说，研究者采用雄性Sprague-Dawley大鼠构建心肌缺血再灌注损伤模型。实验设置8个组，每组6只，包括假手术组（Sham）、单纯褪黑素组（MT）、缺血再灌注组（I/R）、褪黑素预处理组（MT+I/R）、Sirt3抑制剂3-TYP干预组（3-TYP+MT+I/R和3-TYP+I/R）以及Apelin抑制剂ML221干预组（ML221+MT+I/R和ML221+I/R）。缺血再灌注模型通过结扎左前降支冠状动脉30分钟后再灌注3小时建立。褪黑素在再灌注前10分钟经腹腔注射给予，剂量筛选实验表明60 mg/kg为最佳保护剂量。3-TYP（50 mg/kg）和ML221（150 μg/kg）在建模前每两天腹腔注射一次，共三次。实验检测指标包括心肌梗死面积、血清心肌损伤标志物（CK-MB、LDH、cTnI）、氧化应激指标（MDA、ROS、SOD2）、线粒体功能（线粒体膜电位、线粒体通透性转换孔mPTP开放）以及线粒体自噬相关蛋白和基因的表达。此外，通过透射电子显微镜观察线粒体形态变化，通过激光共聚焦显微镜检测LC3与线粒体的共定位情况。
研究结果首先显示，与对照组相比，缺血再灌注组心肌梗死面积、CK-MB、LDH和cTnI水平显著升高，而褪黑素预处理（40、50、60 mg/kg）可剂量依赖性地降低上述损伤指标。在后续以60 mg/kg褪黑素进行的机制实验中，褪黑素显著降低心肌梗死面积和心肌酶水平，但ML221或3-TYP可取消褪黑素的保护作用，且单独使用ML221或3-TYP可加重缺血再灌注损伤。这表明褪黑素的心肌保护作用依赖于Apelin和Sirt3信号通路。
在氧化应激方面，缺血再灌注导致ROS生成和MDA水平显著升高，SOD2表达下降。褪黑素预处理显著降低ROS和MDA水平并恢复SOD2表达，而ML221或3-TYP可消除褪黑素的抗氧化作用。线粒体功能检测显示，缺血再灌注引起mPTP开放增加和线粒体膜电位下降，电镜观察到线粒体嵴丢失、肿胀和形态扭曲。褪黑素可显著抑制mPTP开放、恢复线粒体膜电位并改善线粒体形态；但ML221或3-TYP削弱了上述保护作用，且单独使用抑制剂可加剧线粒体功能障碍。这些结果说明褪黑素通过Apelin/Sirt3途径改善缺血再灌注诱导的氧化应激和线粒体损伤。
在线粒体自噬方面，缺血再灌注导致PINK1、Parkin和LC3II/LC3I比值升高，p62和FoxO3a表达下降，LC3与线粒体共定位增加，提示过度线粒体自噬被激活。褪黑素预处理显著上调p62和FoxO3a的表达，降低PINK1、Parkin和LC3II/LC3I比值，并减少LC3与线粒体的共定位。然而，ML221或3-TYP可消除褪黑素对线粒体自噬的抑制作用，且单独使用ML221或3-TYP可进一步加剧过度线粒体自噬。上述结果提示，褪黑素通过Apelin和Sirt3信号通路抑制缺血再灌注后的过度线粒体自噬。
进一步的机制研究发现，缺血再灌注后Apelin和Sirt3的表达均显著下调，而褪黑素预处理可恢复两者的表达。ML221处理可阻断褪黑素对Sirt3及其下游FoxO3a和SOD2的上调作用，表明褪黑素通过Apelin依赖性方式调节Sirt3介导的线粒体自噬。同时，3-TYP亦可抑制褪黑素诱导的Apelin表达上调，提示Apelin和Sirt3之间存在相互作用。结合前期研究，Sirt3既可通过FoxO3a/PINK1/Parkin通路促进线粒体自噬，也可通过去乙酰化SOD2清除ROS而抑制过度线粒体自噬。因此，褪黑素可能通过激活Sirt3/SOD2途径减少ROS生成，进而抑制过度线粒体自噬，保护心肌细胞。
本研究首次表明褪黑素预处理可通过上调Apelin表达，激活Sirt3信号轴，减少氧化应激和线粒体功能障碍，并抑制缺血再灌注诱导的过度线粒体自噬，从而减轻心肌损伤。该研究揭示了Apelin/Sirt3信号通路在褪黑素心肌保护作用中的关键角色，为褪黑素在心肌缺血再灌注损伤中的临床应用提供了新的理论依据。
本研究的亮点在于：首次阐明了褪黑素通过Apelin/Sirt3信号轴抑制过度线粒体自噬的机制；明确了褪黑素对缺血再灌注大鼠心肌的保护作用具有剂量依赖性；结合了分子生物学、形态学和功能学多种检测手段，系统评估了线粒体自噬和线粒体功能的变化。此外，研究还发现Sirt3特异性抑制可反馈性下调Apelin表达，提示二者之间存在复杂的调控网络。尽管如此，研究仍存在一定局限性，例如未进行Apelin和Sirt3的基因敲除验证、缺乏体外细胞实验支持以及未深入探讨线粒体动力学变化等。未来研究可进一步利用基因干预手段和体外模型验证该信号通路的具体机制，并探索褪黑素对线粒体质量控制其他方面的影响。总体而言，该研究为褪黑素防治心肌缺血再灌注损伤提供了新的分子靶点和潜在治疗策略，具有重要的基础研究价值和潜在的临床转化前景。