学术研究报告：基于单碱基延伸和连接的qPCR扩增方法（SELECT）用于位点特异性N6-甲基腺苷（m6A）修饰的无放射性标记检测

一、作者与发表信息
本研究由北京大学化学与分子工程学院化学生物学系的Yu Xiao、Ye Wang、Qian Tang、Lianhuan Wei、Xiao Zhang及Guifang Jia教授团队完成，发表于Angewandte Chemie International Edition（2018年，卷57，页码15995–16000）。

二、学术背景
N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA中最丰富的转录后修饰，参与RNA代谢调控，但其单一位点检测技术存在局限性。现有方法如m6A-seq（依赖抗体免疫沉淀）分辨率低（约200核苷酸），而单核苷酸分辨率方法（如SCARLET）需放射性标记且耗时。本研究旨在开发一种无需抗体、无放射性标记的高灵敏度方法（SELECT），实现m6A位点的快速、定量检测。

三、研究流程与方法
1. 方法设计与优化
- 原理：SELECT基于m6A对DNA聚合酶单碱基延伸（Bst 2.0 DNA聚合酶）和连接酶（SplintR Ligase）的抑制作用，通过qPCR定量检测。
- 探针设计：两条带PCR接头的DNA探针（Up Probe和Down Probe）与目标RNA互补结合，留出m6A位点缺口。m6A阻碍探针延伸和连接，减少qPCR产物。
- 优化步骤：
- 测试7种连接酶，选择SplintR Ligase（高效率和选择性）。
- 引入非修饰位点（N site，如x@6）作为内参，校正RNA起始量（图1a）。
- 建立单管反应体系，验证dNTP/dTTP均可用于延伸（图S4）。

1. 模型RNA验证

   • 对象：42-mer合成RNA（oligo1和oligo2），含m6A或未修饰A位点。
     
   • 结果：
     
     • SELECT可区分m6A与A，ΔCt达7.6循环（oligo1，GGACU序列）（图1b）。
       
     • 凝胶电泳（PAGE）证实选择性（图1c）。
       
     • 线性关系验证：混合不同比例m6A/A RNA，2^ΔCt与m6A比例呈线性（R²>0.99）（图1d）。
       

2. 生物学样本应用

   • FTO辅助去甲基化：用重组FTO蛋白处理细胞RNA（Hela/HEK293T），去除90% m6A（图2b-c），结合SELECT验证已知位点：
     
     • 28S rRNA：m6A4190位点（图2d）。
       
     • lncRNA MALAT1：m6A2515、m6A2577、m6A2611位点（ΔCt与SCARLET测得修饰分数一致）（图2e）。
       
     • mRNA H1F0：预测位点m6A1211（3’UTR）被证实（图2f）。
       
   • 定量分析：以合成RNA为标准曲线，测定MALAT1 m6A2515位点修饰分数为0.636±0.027（图3）。
     

3. 功能研究

   • CRISPR/Cas9敲低METTL3：
     
     • 杂合细胞（METTL3+/−）中MALAT1 m6A2515修饰显著降低（图4d），证实该位点为METTL3靶点。
       
     • Western blot和UPLC-MS/MS验证METTL3蛋白减少及总m6A水平下降（图4b-c）。
       

四、主要结果与逻辑链
1. 方法学验证：模型RNA实验证明SELECT可区分m6A/A，灵敏度达0.25 fmol（图S7），选择性196.7倍。
2. 生物学应用：FTO辅助SELECT成功鉴定rRNA、lncRNA、mRNA中的m6A位点，且与已知数据一致（如SCARLET）。
3. 功能机制：METTL3敲低实验揭示其对MALAT1特定位点的修饰功能，为m6A写入酶靶点研究提供工具。

五、结论与价值
1. 科学价值：SELECT是首个无需抗体/放射性标记的单碱基m6A检测方法，解决了现有技术（如m6A-IP-qPCR）分辨率低、SCARLET操作复杂的问题。
2. 应用价值：
- 可定量检测低丰度RNA（如lncRNA），最低需0.2 ng polyA-RNA（约200细胞）。
- 兼容其他修饰（如m1A、2’-O-甲基化）检测（图S13），扩展了应用场景。

六、研究亮点
1. 创新方法：首次联合聚合酶延伸抑制和连接酶效率筛选，实现双重选择性。
2. 高效灵活：单管反应、3小时完成，适配常规qPCR仪。
3. 多场景验证：从合成RNA到细胞样本，涵盖rRNA/lncRNA/mRNA。

七、其他发现
SELECT可结合遗传学工具（如基因敲除）研究m6A代谢酶功能，为表观转录组学提供新策略。例如，证实METTL3对MALAT1 m6A2515的特异调控（图4），为后续机制研究奠定基础。

（注：全文未翻译的专业术语如“SCARLET”“UPLC-MS/MS”等保留原名称，关键方法名“SELECT”首次出现时标注为“单碱基延伸-连接qPCR法”）