基因字母表拓展生成高亲和力六字母DNA异源适体的研究
作者及发表信息 本研究的主要作者为Ken-ichiro Matsunaga, Hui Pen Tan, Joo Leng Low, Michiko Kimoto, 以及Ichiro Hirao*。通讯作者为Ichiro Hirao（邮箱：ichiro.hirao@xenolis.com）。所有作者均来自Xenolis Pte. Ltd.，位于新加坡。该研究成果发表于《Journal of the American Chemical Society》期刊，文章于2025年11月27日接收，2026年3月7日修订，并于2026年3月11日被接受发表。DOI链接为：https://doi.org/10.1021/jacs.5c21249。
学术背景 本研究属于化学生物学和核酸工程领域，特别是遗传字母表扩展和核酸适配体（Aptamer）技术范畴。DNA适配体是通过SELEX（指数富集的配体系统进化）技术筛选出的单链DNA分子，能够特异性结合蛋白质、细胞或小分子等靶标。与传统抗体相比，适配体具有化学合成简便、易于修饰、批次间差异小等优点。然而，常规的由A、G、C、T四个天然碱基组成的DNA适配体，其物理化学和结构多样性有限，且DNA分子本身具有高亲水性，这导致大多数传统DNA适配体对靶标的亲和力（以解离常数KD衡量）通常在纳摩尔（nM）范围，限制了其在实际诊断和治疗中的应用。
为突破这一瓶颈，研究者们探索了多种策略，包括对糖环、磷酸骨架或碱基进行化学修饰（例如XNA技术）。另一种颇具前景的策略是“遗传字母表扩展”，即向DNA中引入功能化的非天然碱基对（UBP），作为第五、第六甚至更多的“字母”，从而从根本上增加核酸的化学和结构多样性，拓展其功能。本研究团队长期致力于非天然碱基对的开发，并已成功开发出多种UBP，例如用于高保真复制的Ds-diol-Px配对和用于T7转录的Ds-Pa配对。基于Ds碱基（作为第五字母）开发的EXSELEX（Genetic alphabet expansion for SELEX）方法，已成功筛选出对靶标具有亚纳摩尔级亲和力的异源适配体（Xenoaptamer）。值得注意的是，团队先前在针对登革热病毒NS1蛋白的筛选中，偶然获得了一个同时包含Ds和diol-Px碱基的适配体AptD2。深入的结构生物学研究（冷冻电镜分析）发现，疏水性的Ds碱基通过与邻近碱基的多样化堆积相互作用，塑造了适配体独特的空间结构；而Px/Pa′碱基（第六字母）的丙炔基吡咯部分则能够直接嵌入靶标蛋白的疏水口袋中，形成关键相互作用。这些发现提示，同时利用Ds（增加结构多样性）和Px/Pa′（介导直接疏水相互作用）这两个非天然碱基，有望系统性地产生具有更高亲和力的适配体。因此，本研究的核心目标是：开发并优化一种全新的“六字母EXSELEX”方法，利用包含Ds和Px/Pa′的六字母DNA文库，高效生成针对特定疾病相关蛋白的高亲和力、高特异性异源适配体，以验证其在诊断和治疗应用中的巨大潜力。本研究选择了人白细胞介素-8（IL8，一种关键的炎症和癌症进展相关细胞因子）和人α-凝血酶（Thrombin，血液凝固过程中的核心酶）作为验证靶标。
详细工作流程 本研究的工作流程是一个系统化的、多步骤的适配体筛选与优化过程，主要包含以下几个核心环节：1）六字母DNA文库的设计与构建；2）针对靶标蛋白的六字母EXSELEX筛选；3）筛选后克隆的测序分析与候选序列鉴定；4）候选适配体的化学合成与初步亲和力评估；5）通过二次EXSELEX（Re-EXSELEX）和Ds碱基变体替换（Ds alteration）进行序列优化；6）优化后适配体的深入表征，包括亲和力测定（SPR、EMSA）、特异性验证以及功能应用测试（如ELISA检测、酶活性抑制实验）。
1. 六字母DNA文库的构建： 为了解决六字母DNA序列理论复杂度（对于42个随机位点，为6^42 ≈ 4.8 × 10^32）远超实际操作库容量（~10^15）的难题，研究团队设计了一种巧妙的“亚文库”策略。他们合成了两个六字母DNA文库，命名为XL1和XL2。这两个文库均由40个亚文库组成，每个亚文库在其29个“五字母”随机序列区（包含4% Pa′以及各24%的A、G、C、T）中，预先固定了两个Ds碱基的位置（Ds作为第五字母），而Pa′（作为第六字母）则与其他天然碱基一样，以一定概率随机出现在序列中。这种设计将每个亚文库的复杂度降低到约5 × 10^26，虽然仍很高，但通过后续的再筛选过程加以应对。XL1文库在随机区两端还包含天然的5‘和3’端引物序列，允许形成灵活的末端茎环结构。XL2文库则更进一步，在36个碱基的随机区两侧直接引入了互补的五核苷酸序列，旨在主动促进末端茎结构的形成，提高筛选成功率。
2. 针对IL8和凝血酶的六字母EXSELEX筛选： 筛选过程采用多轮迭代。以IL8为例，大约2 × 10^15个分子的XL1和XL2文库分别用于一个五轮的选择过程。每轮流程包括：将文库与生物素化（或His标签）的靶蛋白孵育（结合），分离DNA-蛋白复合物，洗去未结合DNA，然后通过PCR扩增结合的DNA以用于下一轮筛选。为了提高筛选的严谨性和避免非特异性结合，研究团队优化了每一轮的条件，包括：逐步降低DNA和靶蛋白的浓度、缩短孵育时间、使用更严格的洗涤缓冲液（如添加硫酸葡聚糖或尿素）、采用不同的复合物分离方法（例如，先结合后生物素化以避免生物素标签干扰结合位点）以及引入“预清除”和“后清除”步骤以去除与分离介质非特异性结合的DNA。在筛选过程中，使用包含Ds和dPxTP（用于复制的高保真底物）的qPCR混合物来监测文库的富集情况。富集程度通过qPCR扩增曲线和熔解曲线来判断，与不含靶蛋白的对照组相比，目标文库的熔解峰会变得更尖锐且低温峰消失。
3. 测序分析与候选序列鉴定： 经过五轮筛选后，对富集的文库进行深度测序。由于常规测序仪无法直接读取非天然碱基，研究团队开发了“替换PCR”技术：使用dPa′TP作为底物，在PCR过程中将文库中的Ds和Px碱基替换为天然碱基（主要是A或T），从而实现对包含非天然碱基序列的常规测序。通过分析测序结果中A/T变异的位置，并结合初始亚文库中Ds碱基的预设位置，可以推断出适配体候选序列中非天然碱基的可能位置。针对IL8，从XL1和XL2富集库中都鉴定出了一个相同的共有序列：AAXCCG(T/G)TGGCXAGGC（其中X代表Ds或Px），且其两侧通常存在高度互补、可形成茎结构的序列。从中选取了几个克隆（如102、223）进行后续研究。
4. 化学合成与初步亲和力评估： 根据测序推断出的序列，化学合成了包含Ds和Pa′（化学合成中Px被替换为更稳定的Pa′）碱基的DNA片段。通过电泳迁移率变动分析（EMSA）初步测试了这些候选异源适配体与靶蛋白的结合能力。对于IL8，序列为IL8-102PDA（包含一个Pa′和一个Ds）和IL8-223PD的适配体显示了最强的结合。进一步测试发现，包含两个Ds和一个Pa′的IL8-102PDD也表现出高亲和力。
5. 序列优化：Re-EXSELEX与Ds变体替换 为了提高获得最佳序列的概率，研究团队对初步筛选得到的最佳克隆（IL8-102PDD）进行了二次EXSELEX（Re-EXSELEX）。他们设计了一个“掺杂”文库，即在IL8-102PDD序列的茎区和非关键区域，以一定概率引入随机突变，从而在最优序列的“附近”进行局部优化筛选。经过五轮再筛选和深度测序，获得了数百万条序列。通过对富集序列的比对分析，发现了茎区碱基配对的协变模式，从而优化了茎部结构，得到了改进的序列IL8-102PDDA。表面等离子体共振（SPR）测定显示，其KD值从原始的298 pM（IL8-102PDD）优化到了61 pM（IL8-102PDDA）。此外，研究团队还进行了Ds碱基变体替换（Ds alteration），将适配体中的Ds碱基替换为其类似物Ys或Bs，以微调其堆积相互作用的偶极矩或疏水性。最终，将IL8-102PDDA中第二个Ds替换为Bs，得到了亲和力略有提升的变体IL8-102PDBA（KD = 43.5 pM），其结合速率的改善主要源于解离速率（koff）的降低。
针对凝血酶的筛选流程类似。从筛选结果中也发现了明确的共有序列（TTAXTGG）和可能形成G-四链体及末端茎的结构。通过化学合成、EMSA和SPR测试，鉴定出了高亲和力的适配体，如Thr-204DD和Thr-205DDP。其中，将Thr-204DD中的两个Ds替换为Bs后得到的Thr-204BB，以及原始的Thr-205DDP，均表现出极高的亲和力，SPR测得的KD值分别为1.48 pM和1.66 pM。
6. 深入表征与应用测试： * 亲和力与特异性验证：使用SPR精确测定了优化后适配体的动力学参数（KD， kon， koff）。通过EMSA在存在高浓度尿素或多种非靶标蛋白的条件下，验证了适配体对靶标蛋白的高特异性结合。 * 诊断应用（ELISA）： * 直接ELISA：将生物素化的适配体作为检测探针，直接检测固定在板上的靶蛋白。信号强度与适配体的亲和力（KD值）正相关。研究发现，KD值低于100 pM是获得高灵敏度检测的必要条件。 * 夹心ELISA：使用一种商业化抗IL8抗体作为捕获抗体，优化的异源适配体（如B-IL8-102PDDA）作为检测探针。结果显示，抗体-异源适配体组合的检测灵敏度显著高于商业化的抗体-抗体组合。例如，B-IL8-102PDDA的检测限（LOD）为0.107 pg/mL，而抗体对的LOD为1.227 pg/mL。 * 治疗应用（抗凝活性）：测试了抗凝血酶异源适配体（B-Thr-204BB和B-Thr-205DDP）对凝血酶切割纤维蛋白原生成纤维蛋白这一关键凝血步骤的抑制能力。通过监测纤维蛋白形成导致的光散射变化，发现B-Thr-205DDP在1 nM浓度下能完全抑制0.3 nM凝血酶的活性，其抑制效果优于传统四字母抗凝血酶适配体（如RE31和M08s-1）以及小分子药物达比加群（Dabigatran）。
主要结果 1. 成功开发了六字母EXSELEX方法：通过系统优化筛选流程、文库设计（亚文库策略）和后期序列优化（Re-EXSELEX， Ds变体替换），建立了一套高效生成高亲和力异源适配体的标准化方法。 2. 获得了超高亲和力的异源适配体：针对IL8，获得了KD值为61 pM的优化适配体B-IL8-102PDDA；针对凝血酶，获得了KD值低至1.7 pM的适配体B-Thr-205DDP。这些亲和力达到了皮摩尔（pM）甚至亚皮摩尔水平，远超大多数传统四字母DNA适配体（通常在nM范围）。 3. 验证了在诊断中的优异性能：在夹心ELISA检测中，使用抗IL8异源适配体作为检测探针，其灵敏度（LOD）比商品化抗体对提高了一个数量级以上（0.107 pg/mL vs. 1.227 pg/mL），证明了其在超灵敏检测中的巨大应用潜力。 4. 证明了在治疗中的功能活性：抗凝血酶异源适配体B-Thr-205DDP能高效抑制凝血酶的凝血活性，效果优于现有的一些适配体和小分子抑制剂，展示了其作为新型抗凝治疗药物的前景。 5. 阐明了非天然碱基的关键作用：通过突变实验（将非天然碱基替换为天然碱基）证实，Pa′和Ds碱基对于维持适配体的高亲和力至关重要。Ds碱基通过堆积作用稳定适配体的独特结构，而Pa′碱基的丙炔基吡咯部分则直接与靶蛋白的疏水区域相互作用。这验证了研究最初的设计理念：Ds增加结构多样性，Px/Pa′介导直接疏水相互作用。 6. 证明了高特异性：EMSA实验表明，无论是抗IL8还是抗凝血酶的异源适配体，都只与其特定的靶蛋白结合，而不与其他测试蛋白（如IL6， IFN-γ， VEGF165， HSA， 纤维蛋白原）结合，显示出优异的选择性。
结论 本研究成功开发并验证了一种基于遗传字母表扩展的“六字母EXSELEX”方法，利用包含两个疏水性非天然碱基（Ds和Px/Pa′）的六字母DNA，能够高效、可靠地生成针对目标蛋白的、具有皮摩尔级超高亲和力的DNA异源适配体。该方法通过Ds碱基增强DNA的结构多样性，并利用Px/Pa′碱基直接与靶蛋白的疏水区域相互作用，从而克服了传统四字母DNA适配体在化学和结构多样性上的局限性。研究以IL8和凝血酶为模型靶标，不仅获得了性能卓越的适配体分子，更在诊断（超高灵敏度ELISA）和治疗（高效酶活性抑制）两个层面展示了其巨大的实际应用价值。这项工作标志着DNA适配体技术的一个重大进展，为开发可用于复杂生物样品检测的超灵敏诊断试剂以及用于疾病治疗的新型核酸药物提供了创新且强大的平台。
研究亮点 1. 方法学的创新性：首次系统性地建立了利用两个非天然碱基（Ds和Px/Pa′）进行六字母DNA适配体筛选的完整技术流程（Six-letter EXSELEX），包括优化的文库设计、筛选策略和后期序列优化方案，为常规化生产超高亲和力适配体提供了可行路径。 2. 性能的突破性：所获适配体的亲和力（KD值低至皮摩尔级）和检测灵敏度（LOD低至亚皮克/毫升级）达到了同类技术的顶尖水平，甚至超越了高质量单克隆抗体的性能，具有里程碑意义。 3. 机制阐释的深刻性：研究不仅展示了方法有效，还通过突变实验和前期结构生物学基础，清晰地阐释了不同非天然碱基在适配体功能中的分工：Ds主要贡献于结构塑造，而Px/Pa′直接贡献于靶标结合。这为理性设计更高效的异源核酸分子提供了理论指导。 4. 应用验证的全面性：研究并非停留在体外结合表征，而是深入进行了诊断（夹心ELISA）和治疗（酶活性抑制）两大核心应用场景的功能验证，全面展示了该技术产物的实用化潜力。 5. 解决关键挑战的有效性：通过“亚文库”策略和“Re-EXSELEX”优化，巧妙地应对了六字母序列空间爆炸带来的筛选复杂度挑战，提高了成功率和最终产物的质量。
其他有价值的内容 研究还比较了不同疏水性非天然碱基体系（如本研究的Ds-Px/Pa′体系与文献报道的Z-P体系）的效果差异，指出疏水性可能是本体系成功产生超高亲和力适配体的关键因素之一。此外，文中提及的“替换PCR”测序技术、用于提高核酸酶抗性和便于固定的“迷你发夹”序列（如CG-CG(Biotin-T)AGCG）缀合策略，以及使用掺杂文库进行局部优化的“Re-EXSELEX”策略，均是具有普遍参考价值的技术细节。