本研究由暨南大学第一附属医院眼科、爱尔眼科医院及香港中文大学等多家机构的研究人员合作完成，主要作者包括Hang Chen、Yuqin Liang、Xihao Sun、Hon Fai Chan及Jiansu Chen等。该研究于2025年10月10日发表于 Science Advances 期刊，题为“Generation of vascularized retinal organoids containing microglia based on a PDMS microwell platform”。
视网膜类器官（retinal organoids, ROs）作为一种体外仿生模型，在研究人类视网膜发育和疾病机制方面具有重要价值。然而，目前的ROs存在明显不足：缺乏血管网络和小胶质细胞（microglial cells, MGs），这限制了它们真实再现体内器官复杂性的能力。视网膜神经组织来源于外胚层，而血管来源于中胚层，胚胎起源的差异解释了ROs中血管缺失的原因。以往研究尝试将血管内皮细胞与人脑类器官共培养以形成血管，但这些血管多为简单内皮管状结构，缺乏周细胞和基底膜等完整血管结构。近年来，人类多能干细胞来源的血管类器官（vascular organoids, VOs）已可自组装形成功能性毛细血管网络，为血管化类器官的构建提供了新途径。已有研究通过融合VOs与脑类器官或皮层类器官成功引入血管和小胶质细胞，但在视网膜类器官中构建同时含有血管和小胶质细胞的模型仍是一个挑战。此前有研究利用VOs来源的分散血管细胞与诱导多能干细胞（iPSCs）共培养，虽在约60天内生成了血管化视网膜类器官（vascularized retinal organoids, vROs），但未观察到小胶质细胞。因此，获得含有小胶质细胞的vROs需要参考血管化脑类器官的策略，并结合视网膜类器官的发育特点及其他技术手段。
本研究的目标是构建一种含有血管结构和小胶质细胞的vRO模型，并评估其免疫反应特性及与内层血-视网膜屏障（inner blood-retinal barrier, iBRB）相似的结构特征。研究团队采用V底聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）微孔平台生成VOs，并利用同一平台将ROs置于VOs上方进行融合共培养，最终成功构建了vROs。
研究流程首先涉及VOs的生成。研究团队改进了Wimmer等人建立的VOs分化方案。将iPSCs消化为单细胞后，以每微腔约1000个细胞接种于V底PDMS微孔平台中，离心形成细胞球体。第0天加入含BMP4和CHIR99021的N2B27培养基，第3天更换为含VEGF-A和forskolin的N2B27培养基。第5天将血管聚集体包埋于Matrigel与I型胶原的1:1混合物中，随后在含VEGF-A和FGF-2的血管内皮细胞培养基中培养。第12至15天将血管网络从凝胶中分离，转移至低黏附96孔板中自组装为VOs。为比较不同培养平台对VOs均一性的影响，研究团队还使用96孔V底板和六孔板生成VOs，结果显示PDMS微孔平台与96孔V底板的变异系数均显著低于六孔板，但PDMS微孔平台因其更浅的微孔结构更便于在显微镜下进行类器官融合操作。通过逆转录定量聚合酶链反应检测，发现VOs中血管相关基因CD31、PDGFβ和CDH5随时间逐渐上调。免疫荧光染色显示CD31标记的血管网络被PDGFβ标记的周细胞包绕，且VOs中存在IV型胶原标记的基底膜。此外，VOs能够摄取Dil-Ac-LDL，证实了内皮细胞的功能活性。
第二步为vROs的构建。在第5天的VOs包埋于Matrigel和I型胶原混合物后，将第60天的ROs置于VOs上方，并加入含VEGF-A的视网膜成熟培养基进行共培养。共培养30天和60天后，在vROs中心观察到CD31阳性的管状血管结构，同时检测到CHX10标记的神经视网膜细胞、CRX和OTX2标记的光感受器前体细胞以及AP2α标记的无长突细胞。相比之下，单独培养的ROs中未观察到血管结构。此外，共培养30天的vROs中CD31阳性的内皮样管被PDGFβ阳性的周细胞覆盖，血管平均直径为6.36±1.51微米。在共培养180天的晚期vROs中，通过明场成像观察到光感受器外段的存在，免疫荧光染色显示血管与光感受器细胞共存，部分血管位于深层而视杆和视锥细胞位于浅层，类似于体内人类视网膜的深层毛细血管分布。共聚焦三维成像进一步证实血管位于光感受器细胞下方。这些结果表明vROs可在体外长期培养并维持典型的血管结构。
第三步为转录组分析。研究团队收集共培养30天的vROs和ROs的RNA进行批量RNA测序。主成分分析显示两组之间存在明显差异。以|log2(倍数变化)>1|且q值<0.05为阈值，鉴定出736个上调基因和102个下调基因。基因本体分析表明上调的差异表达基因显著富集于血管生成、血管生成正调控和免疫反应等生物学过程。热图展示了与免疫反应、血管生成和小胶质细胞相关的差异表达基因。逆转录定量聚合酶链反应验证了免疫反应相关基因（C1QC、CD22、TLR2、TLR4、IRF8）、血管生成相关基因（TIE1、ANGPT1、ANGPT2、ECSCR）以及小胶质细胞相关基因（AIF1、TMEM119、SPI1、CSF1R）在vROs中的表达均显著高于ROs。此外，血管标志基因、视网膜稳态基因、视网膜代谢过程基因以及对视黄酸反应基因在vROs中均上调。这些结果提示vROs具有血管生成和免疫反应的特征。
第四步为VOs中小胶质细胞的鉴定。研究发现VOs中含有小胶质细胞。小胶质细胞标志物AIF1的表达随时间逐渐增加。约86%的IBA1阳性小胶质细胞围绕血管分布，形态呈阿米巴样。为确认小胶质细胞身份，研究使用CSF1R抑制剂PLX5622处理VOs，7天后大部分IBA1阳性细胞消失，定量结果显示PLX5622处理组的小胶质细胞密度显著低于DMSO对照组。VEGF-A并非小胶质细胞生成所必需，但VEGF-A组AIF1表达略高且无统计学差异。脂多糖（LPS）刺激后，VOs中TNF-α、IL-8和AIF1表达显著上调，而在PLX5622处理的VOs中这些细胞因子上调受抑，说明VOs中的小胶质细胞参与了LPS诱导的免疫反应。
第五步为vROs中小胶质细胞的来源与功能验证。共培养过程中，小胶质细胞逐渐从VOs迁移并整合入vROs。利用GFP标记的iPSCs生成VOs后再与ROs融合，结果显示约96%的GFP阳性细胞为IBA1阳性小胶质细胞，而ROs表面未发现IBA1阳性细胞，证实vROs中的小胶质细胞来源于VOs而非ROs。这些IBA1阳性小胶质细胞附着于vROs表面并形成分支，提示其分化为驻留样小胶质细胞。在LPS刺激下，与单独培养的ROs相比，vROs中促炎细胞因子TNF-α、IL-8以及抗炎细胞因子IL-10、IL-13的表达均显著上调，表明含有小胶质细胞的vROs能够对炎症刺激产生免疫应答。
第六步为iBRB特征评估。紧密连接蛋白claudin-5是iBRB和血脑屏障的重要分子标志物。免疫荧光染色显示，共培养30天的vROs中CD31标记的血管表达claudin-5，但不表达内皮窗孔标志物PLVAP。相比之下，ROs缺乏claudin-5表达。VOs中的血管也表达claudin-5，但相对荧光强度低于vROs，提示与ROs共培养后紧密连接形成增强。此外，vROs中CD31阳性的血管结构被PDGFβ阳性的周细胞包绕，并被IBA1阳性小胶质细胞包裹，形成了由内皮细胞、周细胞和小胶质细胞组成的神经血管单元样结构。
本研究的结论是成功构建了含有血管结构和小胶质细胞的vRO模型。该模型通过V底PDMS微孔平台将VOs与ROs融合共培养，VOs中的小胶质细胞迁移整合入vROs，血管结构在中长期培养中保持稳定，并表达iBRB特征的claudin-5。vROs能够对LPS刺激产生促炎和抗炎细胞因子的上调，表现出免疫活性。这一模型为视网膜血管疾病研究提供了新的工具，并为未来临床应用如视网膜移植治疗视网膜疾病提供了可能性。
本研究的亮点包括：首次利用V底PDMS微孔平台高效构建了同时含有完整血管结构（包括内皮细胞、周细胞和基底膜）和小胶质细胞的vRO模型，克服了以往血管化视网膜类器官缺乏小胶质细胞的局限；vROs可长期培养至180天，并保持光感受器细胞和血管结构；vROs表现出与iBRB相似的特征，包括claudin-5表达、周细胞覆盖和神经血管单元样结构。研究还发现VOs中存在可响应炎症刺激的小胶质细胞，为神经免疫相互作用研究提供了新平台。尽管该模型具有诸多优势，但仍存在局限性，例如视网膜发育和血管化的详细分子机制尚未阐明，且目前缺乏灌注培养的芯片设计。未来研究将聚焦于先进芯片设计与制造以实现vROs的灌注培养，并探索vROs在视网膜移植治疗中的潜力。