Jacob D. Garritson、Jiabi Zhang、Alan Achenbach、Maroua Ferhat、Emile Eich、Chris J. Stubben、Paige L. Martinez、Anna R. Ibele、Keren I. Hilgendorf 以及通讯作者 Sihem Boudina 等来自美国犹他大学的研究人员于2023年在《Communications Biology》期刊上发表了题为“BMPER is a marker of adipose progenitors and adipocytes and a positive modulator of adipogenesis”的研究论文。
研究背景
肥胖已成为日益严峻的公共卫生问题，高体重指数（BMI）与心血管疾病密切相关。内脏脂肪的积累尤其能够预测不良代谢结局和心血管疾病负担。白色脂肪组织（white adipose tissue, WAT）的扩张主要通过脂肪细胞体积增大（肥大）或脂肪祖细胞（adipose progenitor cells, APCs）的从头招募与分化（增生）实现。内脏脂肪组织（visceral adipose tissue, VAT）中存在功能不同的APC亚群，其异质性和成脂潜力已被早期体外实验和近年来的单细胞转录组研究初步揭示。然而，APC标志物的鉴定及其功能相关性仍有待探索。自分泌和旁分泌信号在白色脂肪组织成脂过程中的调控机制在很大程度上仍不清楚。因此，本研究旨在利用单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）和单核RNA测序（single nuclei RNA-sequencing, snRNA-seq）鉴定人类和小鼠内脏脂肪组织中APC和成脂调节因子的标志物，并进一步探究性别和肥胖对内脏APC组成及成脂潜力的影响。
研究流程与实验方法
本研究主要包含以下几个相互衔接的实验与分析流程：
第一，利用scRNA-seq解析人类和小鼠VAT的细胞组成。研究收集了9例人类大网膜脂肪样本，其中瘦男性2例、肥胖男性2例、瘦女性2例、肥胖女性3例，所有样本均在腹腔镜手术时获取。同时，研究使用8周龄C57BL/6J小鼠，雄鼠取附睾脂肪、雌鼠取卵巢周围脂肪，分别饲喂正常饲料（NCD）或高脂饲料（HFD）8周。每个小鼠样本为10只小鼠脂肪组织的混合样本。对分离得到的基质血管组分（stromal vascular fraction, SVF）进行10x Genomics单细胞RNA测序，随后用Seurat（版本4.0.1）进行数据整合、质控、标准化和聚类分析。根据Pdgfra、Ptprc、Msln和Pecam-1等标志基因的表达，识别出纤维成脂祖细胞（fibro-adipogenic progenitors, FAPs）、免疫细胞、间皮细胞和内皮细胞四大细胞类群。此外，还整合了Rosen课题组已发表的公共snRNA-seq数据（GSE176171）进行验证和补充分析。
第二，性别和肥胖对细胞比例及转录组差异的分析。在人类和小鼠中分别比较瘦与肥胖样本以及雌性与雄性样本中各细胞类群的占比变化。利用Wilcoxon秩和检验筛选差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），并通过clusterProfiler进行通路富集分析。
第三，对Pdgfra阳性FAP细胞进行亚聚类分析。由于人类和小鼠FAP细胞的转录组差异很大，研究采用Seurat的SCTintegration整合方法，将小鼠基因映射到人类同源基因后，用14,211个共同基因进行整合分析，最终识别出7个跨物种的FAP亚群。根据基因签名，明确命名了三个亚群：FAP cluster 1为未定向的APC，FAP cluster 4为定向APC，FAP cluster 6为纤维祖细胞。
第四，体外成脂分化实验评估APC成脂潜力。通过流式细胞分选（FACS）分离小鼠内脏APC，所用分选策略为Lin⁻、CD34⁺、CD29⁺、Sca1⁺、CD200⁻。在含有胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）的成脂分化培养基中诱导分化，通过BODIPY染色定量脂质积累，并通过qPCR检测Pparg、Fabp4和Pdgfra等基因表达。
第五，BMPER的表达定位及功能研究。通过分析scRNA-seq数据鉴定出在人类和小鼠VAT的APC中高表达的BMPER。在小鼠中分离成熟脂肪细胞、Lin⁻ SVF和Lin⁺ SVF，检测Bmper mRNA表达。利用免疫细胞化学共染色BMPER与高尔基体标志物Golgin-97以验证其分泌特性。在3T3-L1前脂肪细胞中检测Bmper在分化过程中的表达和分泌变化，并通过siRNA敲低Bmper来观察对成脂分化的影响。
第六，体内遗传学验证。利用CRISPR/Cas9技术构建Bmper^(fl/fl)条件性敲除小鼠。将来自雄性Bmper^(fl/fl)小鼠附睾脂肪的APC分离后，分别感染表达GFP的对照腺病毒或表达Cre-GFP的腺病毒以敲除Bmper，随后进行成脂分化并检测脂质积累和成脂基因表达。
主要研究结果
在细胞组成方面，scRNA-seq成功鉴定了人类和小鼠VAT中的四个主要细胞类群。肥胖显著降低了人类大网膜脂肪中APC的比例，并显著增加了巨噬细胞比例，这一结果在Rosen课题组的snRNA-seq数据中得到验证。小鼠肥胖样本同样表现出免疫细胞比例升高。性别分析显示，人类女性VAT中免疫细胞比例显著高于男性（p=0.0014），而男性FAP和内皮细胞比例相对较高；小鼠则呈现相反趋势，雌性小鼠FAP比例更高而免疫细胞更少。转录组差异分析表明，小鼠中性别间的转录差异远比人类明显。雄性小鼠FAP高表达Sult1e1、Col6a5和Ace等促成脂/促脂肪生成基因，免疫细胞中脂质相关巨噬细胞标志物Gpnmb和Trem2表达升高，间皮细胞中Lcn2表达升高而Ptger3和Igf1表达降低。
FAP亚聚类分析识别出7个跨物种亚群，其中cluster 1为未定向APC（高表达Pi16、Sema3c、Osr2），cluster 4为定向APC（高表达Icam1和Cebpb），cluster 6为纤维祖细胞（高表达Vcan、Mfap5和Htra3）。肥胖增加了人类大网膜脂肪中定向祖细胞和纤维祖细胞的比例，而小鼠HFD则使未定向APC比例增加。
体外成脂实验显示，NCD饲喂的雄性小鼠APC具有高度成脂能力，而雌性小鼠APC对成脂诱导几乎无反应。肥胖导致雄性小鼠APC成脂能力显著下降。Pparg和Fabp4 mRNA表达在NCD雄性APC分化后显著升高，而肥胖雄性APC的Pparg表达显著低于瘦雄性。雌性未分化APC的Pdgfra表达远高于雄性，但这些细胞在体外仍难以分化。
BMPER分析表明，该基因在人类和小鼠VAT的Pdgfra⁺ APC中高度富集。在小鼠中，Lin⁻ SVF的Bmper mRNA表达最高，显著高于成熟脂肪细胞和Lin⁺ SVF。雄性小鼠APC的Bmper表达是雌性的2倍（p<0.005）。免疫染色证实BMPER与Golgin-97共定位，表明其为分泌蛋白。公共snRNA-seq数据分析进一步揭示BMPER同时标记脂肪祖细胞和成熟脂肪细胞。在人类大网膜脂肪中，APC簇中BMPER⁺细胞比例与BMI呈负相关，而脂肪细胞簇中BMPER⁺细胞比例与BMI呈正相关。
功能实验中，3T3-L1前脂肪细胞分化过程中Bmper mRNA和分泌蛋白水平逐渐升高，在第4天达到峰值。siRNA敲低Bmper显著减少了脂质积累。在原代小鼠APC中，腺病毒介导的Cre重组使Bmper mRNA表达降低约90%，并显著抑制了脂质积累以及Pparg和Fabp4的表达。
研究结论与意义
本研究确认了人类和小鼠VAT中存在主要细胞类群，并揭示了性别和饮食对细胞比例的显著影响。研究首次发现BMPER是人类和小鼠VAT中APC和脂肪细胞的保守标志物，其在Lin⁻ SVF中高度富集，且在内脏APC中的表达显著高于皮下APC。更重要的是，BMPER是成脂分化的正向调节因子，其缺失会显著抑制3T3-L1前脂肪细胞和小鼠原代APC的成脂分化。这些发现为理解内脏脂肪组织成脂调控的分子机制提供了新视角，并提示BMPER可能作为调控脂肪组织扩张和代谢健康的潜在靶点。
研究亮点
本研究的亮点在于：第一，同时利用人类和小鼠的scRNA-seq及公共snRNA-seq数据进行跨物种整合分析，鉴定出保守的APC标志物BMPER；第二，通过体外siRNA敲低和体内条件性基因敲除两种策略验证了BMPER在成脂分化中的功能必要性；第三，揭示了BMPER表达与人类BMI的相关性及其在APC与脂肪细胞中的相反变化趋势，支持其促成脂作用；第四，详细阐明了性别和肥胖对内脏APC组成和成脂潜力的差异影响，为理解性别差异在脂肪生物学中的作用提供了新证据。
其他有价值的内容
研究还发现小鼠内脏APC的成脂潜力存在显著性别差异，雄性APC成脂能力更强，而雌性APC对分化诱导不敏感。这一现象与雌性APC中Pdgfra高表达但成脂能力低下的矛盾结果一致，提示Pdgfra本身可能不足以界定具有成脂能力的APC亚群。此外，研究在方法学上利用CD200作为阴性分选标志物，结合CD34、CD29和Sca1等标志物优化了内脏APC的纯化策略，为后续脂肪祖细胞研究提供了更精确的细胞分离方案。