近期，一项关于汉坦病毒聚合酶结构的重要研究在《PLOS Pathogens》期刊上发表。本研究由牛津大学结构生物学系的Jeremy R. Keown和Loïc Carrique（共同第一作者）、汉诺威实验与临床感染研究中心和卡罗林斯卡医学院等机构的Benjamin E. Nilsson-Payant、牛津大学Ervin Fodor以及牛津大学的Jonathan M. Grimes（共同通讯作者）合作完成，并于2024年12月9日在线刊出。该研究利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术，成功解析了旧世界汉坦病毒代表——汉滩病毒（HTNV）的完整全长聚合酶（L蛋白）结构，并首次捕获了该聚合酶在无RNA、结合病毒RNA启动子以及结合RNA与核苷酸（Nucleotide triphosphate, NTP）等多种状态下的高分辨率构象。这些发现不仅为理解汉坦病毒基因组复制和转录的分子机制提供了前所未有的细节，也为开发靶向病毒聚合酶的抗病毒药物奠定了坚实的结构基础。

本研究的科学领域聚焦于病毒学，特别是负链RNA病毒（negative-sense RNA viruses）的复制机制。汉坦病毒科（Hantaviridae）是一类由啮齿动物传播的具有重要公共卫生意义的病原体，可引发肾综合征出血热（Haemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）等严重疾病，目前尚无特效疗法，现有疫苗效果有限。病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）因其在不同病毒株中高度保守，且在病毒基因组复制和转录中发挥核心作用，被认为是极具潜力的抗病毒药物靶点。尽管近年来针对布尼亚病毒目（Bunyavirales）其他成员的聚合酶结构研究取得了进展，但关于汉坦病毒全长聚合酶的结构信息，尤其是其柔性末端结构域（包括N端核酸内切酶域和C端帽子结合域）的构象及其在病毒生命周期中的动态变化，仍不清楚。因此，本研究的首要目标是建立汉滩病毒聚合酶的表达纯化体系，并利用冷冻电镜技术阐明其全长结构，揭示不同功能域（核心RdRp、核酸内切酶、帽子结合域和C端域）的空间排布，以及RNA和核苷酸结合如何调控聚合酶活性位点（特别是关键基序E）的构象变化，从而为理解病毒转录和复制的分子开关机制提供关键见解。

研究的详细工作流程主要包括五个核心环节：蛋白质表达与纯化、核酸内切酶活性验证、多种状态聚合酶复合物的制备、冷冻电镜数据采集与处理、以及最终的原子模型构建与结构分析。研究对象是汉滩病毒的全长L蛋白，为了克服其高活性核酸内切酶可能导致的表达抑制问题，研究团队采用了两种构建体：野生型（WT）和已报道可抑制内切酶活性的突变体（D97A）。这两种蛋白质均在昆虫细胞（Sf9）中进行重组表达，并通过链霉亲和素（Strep-tactin）亲和层析进行纯化。验证实验（支持信息图S1）证实D97A突变体确实丧失了在锰离子存在下切割RNA底物的能力，而野生型蛋白则保有该活性。由于后续所有冷冻电镜样品均基于D97A突变体（以避免样品降解），这确保了结构研究的稳定性。在蛋白纯化基础上，研究团队设计了四种不同的生化反应条件来捕获聚合酶的不同功能状态，并使用了聚乙二醇化（Pegylation）技术来改善冷冻制样时颗粒的分散性和取向分布。第一种条件仅使用纯化的D97A聚合酶，不添加任何RNA或核苷酸，旨在获得无RNA状态（Apo状态）的结构。第二种条件旨在模拟转录启始前状态，在冰上将聚合酶与病毒5’和3’端RNA启动子（vRNA promoter）、带帽RNA引物及所有四种NTP（ATP, GTP, UTP, CTP）孵育后进行聚乙二醇化处理。第三种条件旨在捕获启动子结合状态，在30°C下将聚合酶与5’和3’ vRNA启动子、带帽RNA引物、UTP以及不可水解的ATP类似物AMP-PNP共同孵育。第四种条件旨在获得核苷酸结合状态，在30°C下将聚合酶与5’和3’ vRNA启动子、带帽RNA引物、四种NTP以及镁、锰离子孵育后进行聚乙二醇化。所有样品均使用配备了SelectrisX能量滤波器和Falcon IV直接电子探测器的Titan Krios显微镜进行冷冻电镜数据采集。数据处理流程统一使用cryoSPARC软件进行，包括运动校正、对比度传递函数（CTF）估计、颗粒挑选（结合了斑点识别、模板匹配和Topaz深度学习模型）、二维分类、三维初始模型生成、异质性细化（heterogeneous refinement）等步骤。针对不同数据集，研究人员采用了特定的策略来分离不同构象的颗粒，例如将无RNA数据集中的颗粒进行多轮异质性细化，最终分离出仅含核心RdRp的结构和包含核心与核酸内切酶的结构；在全长数据集的处理中，则利用已知的构象作为参考，通过三维分类分离出核心结构和显示额外密度（对应柔性末端结构域）的颗粒。对于分辨率较低的结构域（如C端域），研究使用了DeepEMhancer等后处理工具来增强图谱特征以辅助建模。原子模型的构建以AlphaFold2的预测结构为起点，结合已知结构（如汉坦病毒内切酶结构）进行刚体拟合，并在Coot和Phenix中进行迭代的手动调整和精修，最终得到高质量的原子模型。结构比较、分析和图像生成则使用ChimeraX完成。

本研究获得了一系列突破性的结果，系统地揭示了汉坦病毒聚合酶的结构特征和工作机制。首先，在无RNA状态下，研究解析了两个结构：一是分辨率达2.8 Å的仅包含聚合酶核心（残基226-1600）的结构，二是分辨率为3.24 Å的包含核心和N端核酸内切酶（残基1-1600）的结构。 这些结构展示了聚合酶核心的经典RdRp折叠，包含手指、手掌和拇指结构域，并详细注释了催化基序A至F的位置。特别值得注意的是，在无RNA状态下，负责模板RNA进入的基序F（motif F）处于“弯曲”构象，堵塞了模板进入通道。同时，连接手指和手掌域的“引物重排环”（prime-realign loop）也处于缩回状态。这些特征与拉沙病毒、裂谷热病毒等其他布尼亚病毒目聚合酶的无RNA状态结构相似，提示这是一种非活性的封闭构象。其次，通过结合病毒RNA启动子（数据集3），研究人员获得了分辨率为2.79 Å的复合物结构。 有趣的是，尽管添加了完整的5’和3’启动子序列，该结构仅清晰观察到5’ vRNA启动子第2至6位碱基的密度，结合在核心RdRp的“钩状”结合位点。即便如此，RNA的结合已足以诱导聚合酶发生显著的构象重排：基序F从弯曲状态伸直，从而打开了模板进入通道，这种“开放”构象与之前报道的拉克罗斯病毒（La Crosse virus）聚合酶启动子结合结构相似。该结构中，负责催化位点镁离子配位和调控的基序E（残基1167-1185）呈现为典型的三股β-折叠构象。

研究的第三个关键结果是获得了分辨率为3.32 Å的全长汉坦病毒聚合酶结构（数据集2）。 这是首次在原子水平上观察到汉坦病毒聚合酶所有主要结构域（核心RdRp、核酸内切酶、帽子结合域和C端域）的整体排布。核心RdRp结构与无RNA状态相似，基序F保持关闭构象。最重要的发现在于柔性末端结构域的排布方式：核酸内切酶活性位点朝向聚合酶活性位点，而推测的帽子结合域（Cap-binding domain, CBD）则朝向外部，且与聚合酶核心的拇指环结构域有广泛相互作用。通过结构比对，研究人员发现这种结构域排布方式（内切酶朝向内部、CBD朝向外部）与之前报道的布尼亚病毒目其他成员聚合酶的任何已知构象（如拉克罗斯病毒的“帽窃取前”或“帽窃取”构象、拉沙病毒的“延伸”构象、达比班达病毒的“晚期延伸”构象）均不相同，是一种全新的构象。此外，在全长结构中，基序E呈现出一种前所未有的、被相邻β-片层稳定化的长螺旋构象，并远离活性位点。这一发现与近期发表的仅含核心的汉坦病毒无RNA结构报道的螺旋构象一致，但本研究明确了这种螺旋构象与C端域的全局构象相关联。

第四项重要结果来自于核苷酸结合状态的结构（数据集4）。 研究人员获得了分辨率为3.23 Å的聚合酶核心与5’ vRNA启动子及一个NTP结合的复合物结构。密度图清晰地显示了一个三磷酸核苷（建模为ATP）和两个镁离子位于聚合酶活性位点，其中一个镁离子由基序E中的谷氨酸残基E1177配位。与仅结合RNA的结构相比，NTP的结合导致基序E发生了剧烈的构象重排：从β-折叠转变为一种“核苷酸启动”的构象，将E1177“推入”活性位点参与催化。与此同时，与RNA产物/模板双链体出口相关的“模板出口环”也发生了重排。结合近期发表的汉坦病毒聚合酶预启始和延伸状态结构，研究人员提出了一个分子模型来解释病毒基因组复制的内部启始机制（内部启始是指聚合酶不从模板链的3’端开始，而是从内部某个位置开始合成）：在无RNA或RNA结合但无NTP时，基序E处于螺旋或β-折叠构象；当NTP进入活性位点，基序E转变为“核苷酸启动”构象，同时E1177配位镁离子，这阻止了带帽RNA引物（用于转录）的进入，从而将聚合酶功能导向复制。在此构象下，聚合酶可能在模板链内部的特定位置（如第3或第4位）合成一个二核苷酸，随后通过“引物重排”机制将新生链与模板3’端对齐，基序E随之转变为β-折叠构象，允许延伸反应顺利进行。这解释了功能研究中观察到的“先内部合成二核苷酸，再重排进行链延伸”的现象。

本研究通过对汉滩病毒聚合酶多状态高分辨率结构的解析，得出了一系列重要结论：1）首次揭示了汉坦病毒全长聚合酶的完整结构，特别是其帽子结合域和C端域的空间位置，并发现其柔性结构域排列成一种全新的构象，可能代表一种新合成的聚合酶准备结合新合成RNA的状态，或复制预启始状态。2）详细阐明了RNA启动子结合如何诱导基序F构象变化，从而打开模板进入通道，这是启动复制或转录循环的关键步骤。3）最为重要的是，首次系统观察并描述了基序E（又称“引物抓握”基序）的四种不同构象：在全长结构中的螺旋构象、在RNA结合状态下的β-折叠构象、在NTP结合状态下的“核苷酸启动”构象、以及在核心+内切酶结构中的另一种短螺旋构象。这种前所未有的构象多样性揭示了基序E作为分子开关的核心作用，其构象变化直接响应RNA、NTP和镁离子的结合，并可能决定聚合酶是进行转录（需结合带帽引物）还是复制（内部启始）。这项研究不仅填补了汉坦病毒聚合酶结构生物学的关键空白，而且将基序E的动态构象变化与病毒复制的具体步骤（内部启始、引物重排）直接联系起来，提出了一个更为精细和可验证的分子机制模型。

本研究的科学价值和应用价值均十分突出。在科学层面，它极大地增进了我们对布尼亚病毒目聚合酶，尤其是汉坦病毒科聚合酶工作机制的理解。发现基序E的多种构象及其作为功能开关的角色，是领域内的重要突破，可能对理解更广泛的病毒RdRp的调控机制具有启发意义。提出的复制内部启始与构象变化耦合的模型，为后续的功能和生化研究提供了清晰的框架和具体的假说。在应用层面，获得的系列高分辨率结构，特别是帽子结合域和活性位点（包括基序E）的详细原子坐标，为基于结构的合理化药物设计（structure-based rational drug design）提供了精确的蓝图。针对帽子结合口袋或动态变化的基序E开发小分子抑制剂，有望研发出高效、特异的抗汉坦病毒药物。

本研究的亮点在于：1）研究对象的重要性与挑战性：成功攻克了汉坦病毒全长聚合酶表达和结构解析的难题，获得了关键靶点的完整结构信息。2）结构的全面性与新颖性：不是解析单一结构，而是系统地捕获了聚合酶在四种不同功能状态下的构象，特别是全新的全长构象和基序E的多种构象，构成了一个动态的工作周期图景。3）机制见解的深度：超越静态结构描述，将结构观察与已知功能数据紧密结合，提出了关于复制内部启始机制的详细分子模型，将结构变化与生物学功能直接关联。4）技术方法的有效运用：通过精心设计的生化反应条件和聚乙二醇化等样品优化手段，成功稳定并捕获了难以捉摸的全长和NTP结合状态，展示了高超的结构生物学研究策略。这些发现和模型无疑将推动汉坦病毒乃至整个布尼亚病毒目病毒的复制机制研究和抗病毒药物研发进入一个新的阶段。