主要作者与发表信息
本研究由北京中医药大学中药学院的研究团队完成，第一作者为Xiaochun Zheng和Lan Xie（二人为共同第一作者），通讯作者为Shuofeng Zhang和Fang Fang。该论文发表于Phytomedicine期刊第147卷（2025年），文章编号157189，于2025年3月19日投稿，2025年8月22日接收，2025年8月23日在线发表。
学术背景
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最严重的微血管并发症之一，也是导致终末期肾病和糖尿病患者死亡的重要原因。目前临床上针对DN的有效治疗药物仍然有限，主要依赖血糖控制、血压管理和肾素-血管紧张素系统阻断等策略，但疗效尚不理想。因此，开发安全有效的DN治疗药物具有迫切的临床需求。
传统中药（traditional Chinese medicine，TCM）在糖尿病及其并发症的管理中展现了广泛的临床应用价值。玉兰降糖胶囊（Yulan Jiangtang Capsules，YL）是经临床批准的中成药，由黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）、桑叶（Morus alba L.）、牛蒡子（Arctium lappa L.）、蓝花参（Wahlenbergia marginata）、半枝莲（Scutellaria barbata D.Don）、假万寿竹根（Disporopsis longifolia Craib）和青葙子（Celosia argentea L.）等药材组成。既往临床研究表明，YL能有效降低2型糖尿病患者的空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、餐后2小时血糖和糖化血红蛋白水平，并改善糖尿病视网膜病变症状。然而，YL对DN的治疗作用及其分子机制尚不完全清楚。
本研究旨在采用网络药理学（network pharmacology）、代谢组学（metabolomics）和实验验证相结合的综合策略，系统阐明YL治疗DN的潜在机制，为其临床应用提供实验依据。
研究流程与方法
本研究主要包括五个研究环节：
第一环节：YL化学成分鉴定。 采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱串联质谱（UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS/MS）对YL的化学成分进行系统鉴定。流动相采用0.1%甲酸水溶液（A相）和乙腈（B相），梯度洗脱25分钟，分别在正、负离子模式下采集数据。质谱扫描范围为100–1500 m/z，一级质谱分辨率为70,000 FWHM，二级质谱分辨率为17,500 FWHM。数据经Xcalibur 3.2软件和Compound Discoverer软件处理，通过保留时间、前体离子质量和碎片离子质量进行化合物鉴定。
第二环节：网络药理学分析。 将鉴定出的YL化学成分的结构信息输入SwissTargetPrediction和Super-Pred数据库获取药物靶点；从GeneCards和Therapeutic Target Database检索DN相关靶点；取交集获得YL治疗DN的潜在靶点。利用STRING数据库构建蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络，设置物种为“Homo sapiens”，互作评分阈值≥0.7，通过Cytoscape 3.9.0可视化并筛选核心靶点。利用DAVID数据库进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析（显著性阈值p<0.05）。此外，采用AutoDock Tools 1.5.6对排名前十的关键化合物与核心靶点进行半柔性分子对接，以二甲双胍和厄贝沙坦为参考配体，评估结合亲和力。
第三环节：动物实验验证。 采用高脂高糖饮食喂养4周联合链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，35 mg/kg腹腔注射）建立DN大鼠模型。注射STZ后72小时随机血糖≥16.7 mmol/L视为糖尿病模型建立成功。2周后，经尿蛋白和微量白蛋白水平确认肾功能障碍后，将DN大鼠随机分为五组（每组16只，雌雄各半）：模型组（Mod）、阳性药组（二甲双胍150 mg/kg+厄贝沙坦15.75 mg/kg）、YL低剂量组（189 mg/kg）、YL中剂量组（378 mg/kg）和YL高剂量组（756 mg/kg）。药物灌胃给药，每日两次，持续10周。检测指标包括体重、空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（GHb）、24小时尿蛋白（24h UTP）、尿微量白蛋白（mALB）、血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、尿肌酐（UCr）和尿微量白蛋白/肌酐比值（UACR）。肾脏组织采用苏木精-伊红染色（H&E染色）、过碘酸雪夫染色（PAS染色）和透射电子显微镜（TEM）进行病理学评估。同时测定肾组织中的炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）、丙二醛（MDA）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性。采用蛋白质印迹法（Western blotting）检测肾组织中AGEs、RAGE、NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65的蛋白表达水平。
第四环节：非靶向尿液代谢组学。 采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱（UHPLC-QE-MS）对对照组、模型组和YL高剂量组大鼠的尿液样本进行非靶向代谢组学分析。色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱，流速0.3 mL/min，正负离子模式同时采集。数据经MSConvertGUI转换后，使用Weka BioinCloud平台进行主成分分析（PCA），采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）识别组间差异。差异代谢物筛选标准为：倍数变化（fold change，FC）≥2或≤0.5，变量投影重要性（VIP）值>1，且p<0.05。使用MetaboAnalyst 6.0进行KEGG通路富集分析。
第五环节：数据统计分析。 所有数据以均值±标准误表示，采用SPSS 25.0进行统计分析。正态性检验采用Shapiro-Wilk检验，正态分布数据采用单因素方差分析（ANOVA）和LSD事后检验，非正态分布数据采用非参数秩和检验，显著性水平设为p<0.05。图形绘制使用GraphPad Prism 9.0。
主要研究结果
化学成分鉴定结果： 从YL中共鉴定出119个化合物，其中正离子模式下56个，负离子模式下63个，包括57个黄酮类、9个有机酸类、8个酚类、5个木脂素类、5个氨基酸类、4个苯丙素类和4个萜类化合物等，其中104个化合物具有PubChem编号。
网络药理学结果： 鉴定出YL相关靶点791个，DN相关靶点650个，交集靶点143个。化合物-靶点网络分析显示，YL中的活性成分可作用于多个DN靶点，体现了多成分、多靶点的协同作用特点。根据网络拓扑参数，排名前十的关键化合物为：norwogonin、柚皮素（(±)-naringenin）、芹菜素（apigenin）、香叶木素（diosmetin）、野黄芩素（scutellarein）、黄芩素（baicalein）、白杨素（chrysin）、山柰酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）和scutevulin。PPI网络分析确定了十个核心靶点：IL-6、TNF、AKT1、GAPDH、ALB、PPARG、TP53、NF-κB1、STAT3和EGFR。GO富集分析鉴定了929个显著富集条目（p<0.05），KEGG通路富集分析鉴定了170条显著富集通路（p<0.05），其中排名前十的通路包括糖尿病并发症中的AGEs-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、胰岛素抵抗、TNF信号通路和PI3K-Akt信号通路等。分子对接结果显示，十个关键化合物与十个核心靶点的结合能均低于-5.0 kcal/mol，其中与AKT1和TNF的结合尤为紧密（结合能<-7.0 kcal/mol）。结合能排名前五的复合物为：scutevulin-AKT1、baicalein-AKT1、scutellarein-AKT1、chrysin-AKT1和scutevulin-TNF。氢键、疏水相互作用和π-堆积（平行）是化合物与靶点结合的主要作用力。
动物实验验证结果： 与对照组相比，DN模型组大鼠体重显著下降（p<0.05或p<0.01），FBG、GHb、24小时尿蛋白、mALB、SCr、BUN和UACR水平显著升高（p<0.01），UCr水平显著降低。高剂量YL（756 mg/kg）治疗可显著降低FBG、GHb、24小时尿蛋白、mALB、SCr、BUN和UACR水平（p<0.05或p<0.01），并显著升高UCr水平（p<0.05）。三个剂量组中，高剂量组疗效最佳。H&E染色显示模型组肾小管上皮细胞坏死、结构完整性丧失和胞质空泡化，YL治疗可显著改善这些损伤。PAS染色显示YL可减轻肾小球硬化程度。TEM结果显示模型组肾小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）增厚，YL治疗可降低GBM厚度。此外，YL治疗可显著降低肾组织中IL-6、IL-1β和TNF-α水平，降低MDA含量，并升高SOD活性（p<0.05）。
AGEs/RAGE/NF-κB通路验证结果： 与对照组相比，模型组大鼠肾组织中AGEs积累和RAGE蛋白表达显著增加（p<0.05），磷酸化NF-κB p65表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值显著升高。YL治疗可显著降低肾组织中AGEs和RAGE蛋白表达水平（p<0.05），并显著降低磷酸化NF-κB p65表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值。这些结果表明，YL通过调节AGEs-RAGE/NF-κB信号通路抑制炎症反应和氧化应激，从而发挥肾脏保护作用。
代谢组学结果： PCA分析显示对照组与模型组样本呈现显著分离，而YL高剂量组样本的分布与模型组有所不同。OPLS-DA模型的R²值在正负离子模式下分别为0.959和0.989（对照组vs模型组），0.956和1.0（模型组vs YL高剂量组），且Q²斜率均大于0，经200次置换检验验证模型未过拟合。与对照组相比，模型组在正离子模式下有117种代谢物发生改变，负离子模式下有69种代谢物发生改变。YL治疗可逆转5种在模型组升高而在YL高剂量组降低的代谢物（包括2′-脱氧胞苷、octopine、棕榈酸、N-苄氧羰基甘氨酸和N-乙酰神经氨酸）以及4种在模型组降低而在YL高剂量组升高的代谢物（包括α-亚麻酸、L-瓜氨酸、L-酪氨酸和N-L-γ-谷氨酰-L-亮氨酸）。KEGG通路富集分析显示，这些差异代谢物主要涉及苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、α-亚麻酸代谢和精氨酸生物合成等通路。
结论与意义
本研究证实，YL治疗通过调节AGEs-RAGE轴和恢复代谢稳态，显著减轻DN大鼠的肾脏损伤，具体表现为降低血糖水平（FBG、GHb）、改善肾功能指标（SCr、BUN、24h UTP、UACR）、减轻肾脏病理损伤（肾小管上皮细胞坏死、GBM增厚等）、抑制肾脏炎症反应（降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平）、减轻氧化应激（降低MDA、升高SOD活性）以及抑制AGEs/RAGE/NF-κB信号通路活化。同时，YL能够逆转DN大鼠尿液中多种代谢物的异常变化，涉及氨基酸代谢和脂肪酸代谢等途径。
本研究的科学价值在于：第一，系统整合了化学成分分析、网络药理学、分子对接、动物实验验证和非靶向代谢组学等多种研究手段，形成了一个多层次的机制阐明体系；第二，首次揭示了YL通过调节AGEs-RAGE/NF-κB信号轴抑制炎症和氧化应激、以及通过恢复代谢稳态来治疗DN的机制；第三，为YL在DN临床治疗中的应用提供了实验依据。本研究的应用价值在于：为YL这一已获批的临床中成药拓展了DN适应症的科学证据，也为其他中药复方治疗DN的机制研究提供了方法学参考。
研究亮点
本研究的亮点主要体现在以下方面：其一，采用“网络药理学预测—分子对接验证—动物实验确证—代谢组学补充”的多层次整合研究策略，系统深入地阐明了YL治疗DN的分子机制；其二，明确鉴定出YL中的关键活性成分为黄酮类化合物（包括norwogonin、baicalein、scutellarein、chrysin、quercetin等），并预测和验证了其核心作用靶点为AKT1、TNF、IL-6等；其三，聚焦于AGEs-RAGE/NF-κB这一DN发病机制中的核心信号通路，从蛋白表达水平证实了YL的调控作用；其四，通过非靶向代谢组学发现YL可逆转DN大鼠尿液中9种关键代谢物的异常变化，揭示了YL在代谢调控层面的治疗机制；其五，研究采用了临床等效剂量范围的三个剂量组（189、378、756 mg/kg）进行量效关系考察，确定了高剂量组的最佳疗效，为临床用药剂量提供了参考。
研究局限性
作者也在文中指出了本研究的若干局限性：首先，受当前技术条件限制，未能进行生物物理验证（如表面等离子体共振SPR和等温滴定量热法ITC）来直接表征化合物-靶点的相互作用；其次，缺乏体重调节指标的检测和系统性饮食摄入监测，无法解释YL对DN大鼠体重无明显影响的原因；第三，虽然代谢组学分析鉴定了失调的通路，但YL引起的代谢物变化与治疗效果之间的相关性仍需进一步的机制验证。这些局限性为后续研究指明了方向。