本研究由华东师范大学河口海岸学国家重点实验室及河口海岸研究所的严忠正、李秀珍、陈军，以及香港城市大学生物及化学系的谭凤仪共同完成。论文《Combined toxicity of cadmium and copper in Avicennia marina seedlings and the regulation of exogenous jasmonic acid》发表于2015年的期刊 *Ecotoxicology and Environmental Safety*。
一、 学术背景
本研究属于环境科学与植物生理生态学的交叉领域，具体聚焦于红树林生态系统对重金属污染的响应与修复机制。红树林作为海岸带关键生态系统，由于沿海地区工业化和城市化的快速发展，正面临日益严重的重金属污染威胁。红树林沉积物缺氧的特性使其成为重金属的“汇”，大量重金属在此累积，对红树林幼苗的定居和生长构成严峻挑战。重金属毒性主要通过诱导植物产生氧化应激，生成活性氧（ROS），进而破坏细胞膜、核酸和叶绿素等细胞组分。
植物进化出多种机制来应对重金属胁迫，包括酶促抗氧化系统（如超氧化物歧化酶SOD、抗坏血酸过氧化物酶APX等）和非酶促抗氧化剂（如谷胱甘肽GSH、抗坏血酸ASA），以及合成金属螯合配体，如金属硫蛋白（Metallothioneins, MTs）和植物螯合肽（Phytochelatins, PCs）。其中，茉莉酸（Jasmonic Acid, JA）作为一种脂质衍生的信号分子，在植物响应生物和非生物胁迫（包括重金属胁迫）中扮演着重要角色。已有研究表明，外源施加JA可以通过增强抗氧化能力、降低膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量等途径，缓解重金属对植物的毒害。
然而，自然界中的污染通常是多种重金属共存的复合污染。镉（Cd）和铜（Cu）是红树林湿地中两种广泛存在的主要重金属污染物。Cu是植物必需的微量元素，但高浓度时具有毒性；Cd则是一种无论浓度高低均无已知生物学功能的高毒性金属。关于Cd和Cu对植物的复合毒性效应及其相互作用机制，尤其是对于红树林植物，尚不完全清楚。同时，关于JA如何调控植物（特别是红树林植物）应对复合重金属胁迫的机制研究也较为缺乏。
因此，本研究旨在：1）探究Cd和Cu单一及复合处理对白骨壤（*Avicennia marina*）幼苗的毒性效应；2）研究外源茉莉酸（JA）对Cd和Cu复合胁迫下白骨壤幼苗的缓解作用及其生理与分子机制，包括对叶绿素含量、膜脂过氧化、重金属吸收、抗氧化酶活性、内源JA浓度以及金属硫蛋白基因（*AmMT2*）表达的影响。
二、 研究流程详述
本研究设计严谨，包含多个连续的实验流程，具体如下：
1. 实验材料与预处理： 研究选取健康、大小相近的白骨壤繁殖体，播种于装有沙子的塑料盆中，使用半强度的日本花园试验营养液进行水培。实验在人工气候室中进行，严格控制光温条件（25°C，70%相对湿度，16小时光照/8小时黑暗）。待幼苗第三对叶片完全展开后，开始进行胁迫处理。
2. 单一与复合重金属毒性实验： 为了模拟自然环境中的浓度背景（华南红树林沉积物中Cd浓度通常为0-58 μmol kg⁻¹，Cu为288-1440 μmol kg⁻¹），研究设定了两个浓度的Cd（9和90 μmol L⁻¹，记为Cd1和Cd2）和Cu（90和900 μmol L⁻¹，记为Cu1和Cu2）。实验共设置9个处理组，每组3个重复：(i) 对照；(ii) Cd1；(iii) Cd2；(iv) Cu1；(v) Cu2；(vi) Cd1+Cu1；(vii) Cd1+Cu2；(viii) Cd2+Cu1；(ix) Cd2+Cu2。处理第9天，收集幼苗叶片，测定MDA和内源JA含量，以评估毒性效应并筛选出最具毒性的复合处理组合用于后续实验。
3. 外源JA缓解实验： 基于上一部分结果，选择诱导产生最高MDA含量（即毒性最强）的处理组合（Cd1+Cu2）作为复合重金属胁迫（HM）条件。在此背景下，研究外源JA的缓解作用。设置6个处理组：(i) 对照；(ii) HM（仅复合重金属）；(iii) HM + 0.1 μmol L⁻¹ JA (JA1)；(iv) HM + 1 μmol L⁻¹ JA (JA2)；(v) HM + 10 μmol L⁻¹ JA (JA3)；(vi) HM + 100 μmol L⁻¹ JA (JA4)。为确保实验一致性，对照和HM组也添加了等量的乙醇（JA溶剂）。处理期间，每2天更换一次营养液以维持养分和胁迫物浓度稳定。在处理第9天，收集所有处理的幼苗样品，用于后续各项指标测定。
4. 时间动态研究： 为了解胁迫与缓解过程中的动态变化，对以下4个处理组（i）对照；（ii）HM（Cd1+Cu2）；（iii）单独JA2（1 μmol L⁻¹）；（iv）HM+JA2，分别在处理第1、5、21天采样，测定叶片MDA、内源JA含量以及抗氧化酶活性。
5. 测定指标与方法： * 叶绿素含量： 采用丙酮-乙醇混合液提取法，通过分光光度计在特定波长（470, 645, 663 nm）下测定吸光度，计算叶绿素a、b和总量。 * 丙二醛（MDA）含量： 采用硫代巴比妥酸（TBA）法，通过测定脂质过氧化产物MDA与TBA反应产物的吸光度（450, 532, 600 nm），计算MDA浓度，以反映膜脂过氧化程度。 * 重金属（Cd, Cu）积累量： 将植物样品（根和叶）烘干、灰化、酸消解后，使用原子吸收光谱仪（PerkinElmer AAnalyst 800）测定Cd和Cu浓度。计算转运因子（TF = 叶片金属浓度/根部金属浓度）以评估金属从根向叶的转运能力。 * 内源茉莉酸（JA）浓度： 采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒进行测定。 * 抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性： 提取叶片酶液，通过监测反应体系中抗坏血酸在290 nm处吸光度的下降速率来测定APX活性，以单位时间内氧化的抗坏血酸量表示。 * 金属硫蛋白基因（*AmMT2*）相对表达量： 提取叶片总RNA，反转录合成cDNA。采用实时定量PCR（RT-PCR）技术，以18S rRNA为内参基因，使用特异性引物扩增*AmMT2*基因，通过2^(-ΔΔCt)法计算其相对表达量。
6. 数据分析： 数据以平均值±标准差表示。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）检验Cd和Cu单一及交互作用对叶片MDA和JA含量的影响。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）及事后多重比较（Tukey检验）分析其他参数在不同处理组间的显著性差异。所有统计分析使用SPSS 16.0软件完成。
三、 主要研究结果
1. Cd和Cu的复合毒性效应： 双因素方差分析显示，单一Cd或Cu处理对叶片MDA含量无显著影响，二者的交互作用也不显著。然而，与对照相比，Cd1+Cu2和Cd2+Cu1这两种复合处理在第9天显著提高了叶片MDA含量。这表明，单独的低剂量Cd或高剂量Cu可能未达到毒性阈值，但二者结合产生了协同或加成的毒性效应，导致细胞膜氧化损伤加剧。其中，Cd1+Cu2组合诱导的MDA含量最高，被确定为后续JA缓解实验的胁迫条件。
2. 外源JA对光合色素和膜损伤的缓解作用： 复合重金属（HM）处理显著降低了叶片叶绿素b和总叶绿素浓度，并提高了MDA含量，证实了其光合抑制和膜损伤毒性。外源JA的添加有效地逆转了这些负面影响。具体而言，1 μmol L⁻¹ JA（JA2）处理使MDA含量恢复至与对照相当的水平。同时，低至中等浓度的外源JA（0.1, 1, 10 μmol L⁻¹）也缓解了复合金属对叶绿素的损害，使叶绿素b和总叶绿素浓度恢复至对照水平。这表明适宜浓度的外源JA能够有效保护光合机构并减轻膜脂过氧化。
3. 外源JA对重金属吸收与转运的影响： 处理9天后，复合重金属处理导致Cd和Cu在根和叶中显著积累。外源JA处理显著影响了Cd的积累模式：1, 10, 100 μmol L⁻¹ JA均显著降低了根部对Cd的积累；其中10 μmol L⁻¹ JA还显著降低了叶片中Cd的积累。相应地，1和10 μmol L⁻¹ JA处理也显著降低了Cd从根到叶的转运因子（TF）。然而，外源JA对Cu在根和叶中的积累以及其转运因子均未产生显著影响。这一结果提示，JA可能通过某种特异性机制（如影响Cd的转运蛋白竞争或改变木质部装载过程）来抑制Cd的吸收和向上运输，而对Cu的代谢途径影响较小。
4. 外源JA对抗氧化酶活性的影响： 复合重金属（HM）处理在第9天抑制了叶片中APX的活性。然而，在HM胁迫下添加1 μmol L⁻¹ JA（JA2）和10 μmol L⁻¹ JA（JA3）显著增强了APX的活性，甚至高于对照水平。时间动态分析显示，在第1天和第9天，HM处理均抑制了APX活性，而HM+JA2处理则恢复或增强了该酶活性（第5天趋势相同但不显著）。到第21天，各处理组间的APX活性无显著差异，可能意味着植物自身产生了适应或胁迫响应进入新阶段。这表明外源JA通过快速激活APX等抗氧化酶系统，帮助清除过量ROS，是缓解氧化胁迫的关键机制之一。
5. 内源JA的动态变化： 双因素方差分析表明，单一Cd或Cu处理均能显著刺激叶片内源JA含量的增加，但二者交互作用不显著。在处理第9天，高浓度Cu（Cu2）以及所有Cd和Cu的复合处理均显著提高了内源JA水平。在JA缓解实验中，内源JA浓度随着外源JA添加浓度的增加而呈上升趋势，其中HM+100 μmol L⁻¹ JA（JA4）处理组的内源JA含量显著升高。时间进程显示，HM+JA2处理在第5天和第9天均能刺激内源JA水平升高，而单独施加JA2处理则无显著影响。这提示重金属胁迫和外源JA都能诱导内源JA的生物合成或积累，可能形成一个正反馈调节环路，放大JA信号，从而协调植物的抗逆反应。
6. 外源JA对金属硫蛋白基因（*AmMT2*）表达的调控： 复合重金属（HM）处理本身就能显著上调叶片中*AmMT2*基因的表达（约为对照的3.5倍）。外源JA的添加进一步增强了这种上调效应：与单独的HM处理相比，1和10 μmol L⁻¹ JA处理使*AmMT2*的相对表达量分别提高到对照的8.0倍和8.4倍。然而，过低（0.1 μmol L⁻¹）或过高（100 μmol L⁻¹）浓度的JA则未显示出刺激效应。这表明，适宜浓度的外源JA能够协同重金属胁迫，强烈诱导*AmMT2*基因的表达。金属硫蛋白能够通过其富含半胱氨酸的结构域螯合重金属离子，从而降低细胞内游离重金属浓度，减轻毒害。因此，JA通过上调*AmMT2*表达，增强了植物对Cd的螯合与解毒能力。
四、 研究结论与价值
本研究表明，低剂量Cd（9 μmol L⁻¹）与高剂量Cu（900 μmol L⁻¹）的复合处理对白骨壤幼苗产生协同毒性，表现为膜脂过氧化加剧（MDA升高）和光合色素减少。外源施加适宜浓度（1-10 μmol L⁻¹）的茉莉酸（JA）能有效缓解这种复合毒性。其缓解机制是多方面的：1）生理层面：恢复并增强抗氧化酶（如APX）的活性，减轻氧化损伤；2）转运层面：减少Cd从根部向叶片的转运，降低地上部Cd的积累；3）分子层面：显著上调金属硫蛋白基因（*AmMT2*）的表达，增强植物对Cd的细胞内螯合与解毒能力。此外，胁迫和外源JA均能诱导内源JA水平的升高，可能参与了信号放大与调控。
本研究的科学价值在于，首次在红树林植物白骨壤中系统揭示了外源JA缓解Cd和Cu复合胁迫的生理与分子机制，明确了JA通过“抗氧化防御增强”、“重金属转运抑制”和“解毒基因表达上调”三条途径发挥保护作用。这深化了对植物激素调控重金属胁迫响应的认识，特别是对复合污染情境下的理解。其应用价值在于，为利用植物生长调节剂（如JA）进行红树林湿地重金属污染的生物修复和苗木培育实践提供了重要的理论依据和技术参考。例如，在受污染滩涂进行红树林人工恢复时，可通过施用适宜浓度的JA来提高幼苗的定植成活率和抗逆性。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的内容
研究还讨论了JA可能通过影响气孔关闭、降低蒸腾作用来间接减少Cd向地上部运输的潜在机制，并与其他植物激素（如脱落酸ABA、油菜素内酯BR）的作用进行了对比和关联。同时，作者指出JA除了诱导MTs外，还可能通过促进谷胱甘肽（GSH）和植物螯合肽（PCs）的合成来协同解毒，这为后续研究指明了方向。最后，作者建议未来需要针对更多种类的重金属、更广泛的植物物种以及不同的暴露浓度进行深入研究，以更全面地理解JA的调控作用。