Xuezhou Yuan、Xin Yu、Wei Zhao和Jingxian Sun等研究者于2025年在《Bio-protocol》期刊发表了题为《A Practical CRISPR-Based Method for Rapid Genome Editing in Caulobacter crescentus》的研究。该研究由中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所、定量合成生物学国家重点实验室等团队合作完成。
背景与目标
该研究聚焦于α-变形菌纲模式生物 新月柄杆菌（Caulobacter crescentus） 及其近缘种（如农杆菌和中华根瘤菌）的基因组编辑难题。这类微生物因缺乏有效的非同源末端连接（NHEJ）修复机制，传统通过同源重组（HR）的基因编辑方法效率低且耗时。虽然CRISPR/Cas9技术在其他生物中已广泛应用，但其在CRISPR/Cas9难编辑微生物（CRISPR/Cas-recalcitrant organisms）中的适用性受限，原因包括SpCas9表达毒性、编辑逃逸（CRISPR escape）等问题。为此，研究团队开发了CRISPR/SpCas9m报告系统（CRISPR/SpCas9m-reporting system），旨在实现高效、快速的基因编辑。
研究方法与流程
1. gRNA设计与质粒构建
- gRNA筛选：使用在线工具CHOPCHOP设计靶向目标基因（如spmx）的gRNA，选取效率评分>60且脱靶风险低的序列。
- 同源臂（H-arms）设计：选取目标基因上下游各2000 bp序列作为同源重组模板。
- 编辑质粒组装：以psjx016为基础质粒，通过吉布森组装（Gibson Assembly）将gRNA、同源臂插入载体，构建包含SpCas9变体（SpCas9m）和荧光报告基因sfGFP的编辑系统。
2. 电转化与编辑筛选
- 感受态制备：将C. crescentus NA1000培养至对数期，经低温洗涤制备电转化感受态细胞。
- 电转化参数：电压2.5 kV，电容25 μF，电阻200 Ω，转化后加入香草酸（vanillic acid）诱导SpCas9m表达。
- 荧光预筛：通过蓝光灯检测sfGFP荧光强度，筛选高表达SpCas9m的克隆，减少编辑逃逸事件。
3. 编辑验证与质粒消除
- PCR验证：设计跨越敲除区域的引物，通过菌落PCR和测序确认基因删除。
- 质粒消除：无抗性培养后，通过复制平板筛选成功消除编辑质粒的菌株。
关键结果
- 高效编辑：系统在C. crescentus中编辑效率达10%-80%，且适用于7.7 kb大片段删除。
- 跨物种适用性：成功应用于农杆菌（Agrobacterium fabrum）和中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）。
- 时间优势：从设计到验证仅需1周，远快于传统方法（通常需数周）。
研究意义与创新
- 科学价值：解决了α-变形菌纲微生物的基因组编辑瓶颈，为研究其细胞周期、极性分化等机制提供了工具。
- 技术突破：
- SpCas9m-荧光报告融合：通过sfGFP实时监测SpCas9m表达，优化编辑效率。
- 诱导表达调控：香草酸启动子（pVan）精确控制SpCas9m表达，减少毒性。
- 应用潜力：可推广至其他难编辑微生物，助力工业、农业微生物的遗传改造。
亮点与局限
- 亮点：
- 首次在C. crescentus中实现CRISPR/Cas9高效编辑。
- 多步骤集成化设计（预筛、验证、质粒消除）提升可靠性。
- 局限：编辑效率受靶点位置影响，需优化gRNA设计策略。
补充信息
团队在《Nucleic Acids Research》的后续研究（doi:10.1093/nar/gkaf353）进一步验证了该系统在多重编辑和大片段插入中的适用性。
（注：全文遵循学术报告规范，术语如CRISPR escape译为“编辑逃逸”并在首处标注英文，方法学细节如Gibson Assembly保留原名。）