关于SigIRR通过TLR4信号通路缓解重症急性胰腺炎肠道黏膜损伤的原创研究报告

一、 研究作者、机构与发表信息 本研究由刘洋、周峰、宋燕平、魏胜龙、程博文、刘丁玮、熊慧芳、谢勇和周小江共同完成。作者单位主要来自南昌大学江西医学院第一附属医院消化病医院消化内科、江西省消化疾病重点实验室、江西省消化疾病临床研究中心，以及南昌大学第一附属医院质量控制科。该研究以题为“SigIRR alleviates intestinal mucosal damage in severe acute pancreatitis via the TLR4 signaling pathway”发表于期刊 *Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology*，于2025年发表（卷19，文章ID 101608）。

二、 学术背景与研究目的 本研究属于消化系统疾病，特别是重症急性胰腺炎（Severe Acute Pancreatitis, SAP）病理生理机制与治疗策略的跨学科领域，涉及分子免疫学、肠道微生物学及细胞信号转导。

研究背景：SAP是一种高死亡率的腹部急症，死亡率可达30%。其病情恶化的一个关键早期事件是肠道屏障功能障碍。肠道屏障完整性受损后，细菌及其产物（如脂多糖，LPS）易位，可导致胰腺二次感染、全身炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能衰竭（MOF）。因此，维持肠道屏障功能是改善SAP预后的重要策略。Toll样受体4（Toll-like Receptor-4, TLR4）信号通路在SAP相关的全身和肠道炎症中被证实过度激活，与肠道屏障损伤密切相关。单免疫球蛋白IL-1受体相关分子（Single Immunoglobulin IL-1 Receptor-Related Molecule, SigIRR，也称为IL-1R8或TIR8）是IL-1受体家族的负向免疫调节分子，已知可通过抑制TLR/IL-1R超家族信号（包括TLR4通路）来负向调控炎症反应。然而，SigIRR是否通过调节TLR4通路在SAP肠道屏障损伤中发挥保护作用，其具体机制及其对肠道菌群的影响尚不明确。

研究目的：本研究旨在探究SigIRR在SAP肠道屏障功能障碍中的作用，并阐明其是否通过负向调控TLR4信号通路来发挥保护效应，同时观察SigIRR对肠道菌群的影响，以评估其作为SAP治疗新靶点的潜力。

三、 详细研究流程与方法 本研究是一项综合性的基础与转化医学研究，结合了体外细胞模型、体内动物模型以及临床样本分析，流程严谨且多层次。

第一流程：临床样本收集与SAP动物模型建立及表型验证 * 研究对象与样本量：收集了4例SAP患者的腹水（Ascitic Fluid, AF），其中2例为高甘油三酯血症性胰腺炎腹水（H-AF），2例为胆源性胰腺炎腹水（B-AF）。动物实验使用6-8周龄雄性C57BL/6小鼠，每组6只，随机分为对照组和SAP模型组。 * 处理方法与实验：通过腹腔重复注射雨蛙素（Cerulein）联合LPS静脉注射构建小鼠SAP模型。评估指标包括：1) 胰腺损伤：通过苏木精-伊红（H&E）染色进行组织病理学评分，检测血清淀粉酶和脂肪酶活性。2) 肠道损伤：通过H&E染色观察小肠绒毛长度、隐窝深度和固有层水肿；通过阿尔新蓝-过碘酸雪夫（PAS-AB）染色观察黏液层厚度；通过荧光原位杂交（FISH）使用通用细菌探针EUB338检测细菌易位；通过qPCR和免疫荧光检测肠道紧密连接蛋白（ZO-1, Claudin-1）和炎症因子（TNF-α， IL-1β， IL-6）的表达。 * 结果与逻辑衔接：成功建立了SAP小鼠模型，证实模型组出现显著的胰腺水肿、炎症细胞浸润、坏死以及肠道黏膜结构损伤（绒毛缩短/缺失、黏液层变薄）。同时，肠道屏障相关蛋白表达下调，炎症因子表达上调。这为后续研究SigIRR在SAP肠道损伤中的作用提供了明确的病理表型基础。

第二流程：体外肠道上皮屏障模型建立及损伤诱导 * 研究对象：人结肠癌细胞系Caco-2和正常人肠道上皮细胞系HIEC。 * 处理方法与实验：将细胞接种于Transwell小室培养，形成单层上皮屏障模型。通过监测跨上皮电阻（Transepithelial Electrical Resistance, TEER）和荧光黄（Lucifer Yellow）通透性（Paracellular Permeability, Papp）来评估屏障完整性。使用LPS以及从SAP患者获取的H-AF和B-AF刺激细胞屏障模型。 * 结果与逻辑衔接：LPS和H-AF处理能时间依赖性地显著降低TEER值，增加Papp，并下调ZO-1和Claudin-1的表达，成功模拟了SAP状态下肠道屏障功能的破坏。值得注意的是，H-AF引起的屏障破坏效应强于B-AF，提示不同病因的SAP腹水成分可能对肠道损伤程度有差异。此部分建立了可靠的体外研究平台，用于后续机制探讨。

第三流程：SigIRR与TLR4信号通路在SAP中的表达与关联分析 * 研究方法：1) 生物信息学分析：利用Gene Expression Omnibus（GEO）数据库分析公开数据集，发现SAP患者及模型小鼠中SigIRR表达显著降低，且与疾病严重程度正相关。通过Metascape、GeneMANIA和Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA）工具进行富集分析和相关性分析，提示SigIRR与TLR4信号通路（关键分子包括TLR4、MyD88、NF-κB）存在显著关联。2) 实验验证：在体外（LPS/AF刺激的Caco-2和HIEC细胞）和体内（SAP模型小鼠肠道组织）检测SigIRR以及TLR4通路关键分子（TLR4， MyD88， p-NF-κB）的表达。 * 结果与逻辑衔接：实验证实，在SAP状态下，无论是细胞还是组织水平，SigIRR的表达均显著下调，而TLR4信号通路被激活（TLR4、MyD88、p-NF-κB表达上调）。生物信息学与实验数据共同指向SigIRr可能通过TLR4通路参与SAP肠道炎症调控，这为后续的功能增益和缺失实验提供了明确的分子靶点和理论假设。

第四流程：SigIRR功能研究——在体外和体内过表达与敲低 * 研究对象与样本量：体外为Caco-2和HIEC细胞；体内为C57BL/6小鼠（每组6只）。 * 处理方法与实验： * 体外：使用慢病毒载体构建稳定过表达SigIRr的肠道上皮细胞系（OE-SigIRR）。 * 体内：通过腹腔注射不同血清型的腺相关病毒（Adeno-Associated Virus， AAV）筛选出靶向小肠效率最高的AAV10血清型。随后，构建并包装AAV-SigIRR（过表达）和AAV-shSigIRR（敲低）病毒，通过腹腔注射感染小鼠肠道，持续4周后，再诱导SAP模型。 * 检测指标：在体外，检测OE-SigIRR细胞在LPS/H-AF刺激下的炎症因子表达、屏障蛋白表达及TLR4通路活性。在体内，评估过表达或敲低SigIRR对SAP小鼠肠道病理损伤、炎症因子水平、屏障蛋白表达、胰腺炎症（病理评分、血清酶学）以及TLR4通路活性的影响。 * 结果与逻辑衔接：1) 功能验证：在细胞水平，过表达SigIRR能显著减轻LPS/H-AF诱导的炎症因子释放，增强紧密连接蛋白表达，并抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活。2) 体内保护作用：与SAP模型组相比，AAV-SigIRR治疗组小鼠的肠道黏膜损伤（绒毛结构、黏液层、细菌易位）显著减轻，肠道和全身炎症反应降低，胰腺病理损伤和血清淀粉酶/脂肪酶水平改善，同时肠道TLR4通路被抑制。相反，敲低SigIRR则加剧了上述所有损伤。这些结果直接证明了SigIRR在SAP中对肠道屏障和胰腺具有保护作用，且该作用与抑制TLR4信号通路相关。

第五流程：SigIRR对SAP小鼠肠道菌群的影响 * 研究对象与样本量：对照组、SAP模型组、AAV-SigIRR组和AAV-shSigIRR组小鼠的新鲜粪便样本。 * 处理方法与实验：提取粪便细菌DNA，对16S rRNA基因的V3-V4区进行扩增子测序（Illumina NovaSeq平台）。利用QIIME2等工具进行生物信息学分析，包括α多样性（Chao1， Shannon指数）、β多样性（PCoA分析）、线性判别分析效应量（LEfSe）分析以及基于COG和KO数据库的功能预测。 * 结果与逻辑衔接：SAP导致小鼠肠道菌群α多样性显著降低，菌群结构发生改变（β多样性差异）。过表达SigIRR能够逆转SAP引起的α多样性下降，并使菌群结构向对照组靠拢。LEfSe分析显示SigIRR过表达影响了特定菌群的丰度。功能预测表明，SigIRR能帮助恢复SAP小鼠肠道菌群的功能丰度。这揭示了SigIRR的保护作用可能部分通过调节肠道微生态实现，为其多维度作用机制提供了新证据。

第六流程：数据分析方法 研究使用SPSS 26.0进行统计分析。连续数据以均值±标准差表示。对于符合正态分布且方差齐性的数据，采用Student‘s t检验或单因素方差分析（ANOVA）后接Tukey’s事后检验。对于非正态分布或方差不齐的数据，采用适当的非参数检验。P值<0.05被认为具有统计学显著性。

四、 主要研究结果 1. SAP导致肠道黏膜损伤并伴随SigIRR下调与TLR4通路上调：成功建立了SAP小鼠和细胞模型，证实SAP状态下存在严重的肠道屏障结构破坏和功能丧失。同时，在患者数据、动物模型和细胞模型中均一致发现SigIRR表达显著降低，而TLR4信号通路被激活。 2. LPS及SAP腹水可破坏肠道上皮屏障功能：体外实验表明，LPS和SAP患者腹水（尤其是H-AF）能直接损伤Caco-2和HIEC单层屏障，表现为TEER下降、通透性增加、紧密连接蛋白表达减少。 3. 过表达SigIRR在体外和体内均能减轻SAP相关损伤： * 体外：在肠道上皮细胞中过表达SigIRR，能显著抵抗LPS/H-AF引起的炎症因子（如TNF-α， IL-1β， IL-6）释放增加，并促进屏障蛋白（ZO-1， Occludin， Claudin-1）的表达。 * 体内：通过AAV10载体在肠道特异性过表达SigIRR，能有效缓解SAP小鼠的肠道黏膜病理损伤（改善绒毛结构、增厚黏液层、减少细菌易位），降低肠道局部和全身炎症水平，并减轻胰腺的炎症和坏死。相反，敲低SigIRr则加重所有损伤。 4. SigIRR的保护作用机制涉及抑制TLR4信号通路：过表达SigIRR能显著下调LPS/H-AF刺激的细胞以及SAP小鼠肠道组织中TLR4通路关键分子（MyD88， TRAF6， p-NF-κB）的表达。而敲低SigIRR则产生相反效果。这直接证明了SigIRR通过负向调控TLR4信号通路来发挥其抗炎和保护屏障的作用。 5. SigIRr调节SAP小鼠的肠道菌群：肠道菌群测序分析表明，SigIRR过表达能够逆转SAP引起的肠道菌群α多样性下降，改变菌群组成，并促进有益菌生长、抑制机会致病菌，使菌群功能谱更接近健康状态。

五、 研究结论与价值 结论：本研究证实，SigIRR在重症急性胰腺炎中表达下调。过表达SigIRR可以通过负向调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，减轻肠道上皮的炎症反应，增强紧密连接蛋白表达，从而维护肠道黏膜屏障的完整性。完整的肠道屏障减少了细菌/内毒素易位，进而缓解了胰腺及全身的过度炎症反应。此外，SigIRR还能改善SAP相关的肠道菌群失调。因此，SigIRr在SAP的发生发展中扮演着重要的保护性角色。

意义与价值： * 科学价值：本研究深入阐明了SigIRR在SAP肠道损伤中的新型保护机制，将肠道屏障、固有免疫信号通路（TLR4）和肠道微生物组这三个SAP病理生理的关键环节通过SigIRR这一分子连接起来，为理解SAP的“肠-胰轴”交互作用提供了新的分子视角。 * 应用价值：研究结果表明，SigIRR是一个潜在的治疗SAP的新靶点。通过药物或基因治疗手段上调SigIRR的表达或活性，可能成为未来治疗SAP、保护肠道屏障、遏制全身炎症反应的新策略。

六、 研究亮点 1. 机制创新性：首次系统性地揭示了SigIRR通过抑制TLR4信号通路在SAP肠道屏障保护中的作用，并关联了肠道菌群调节，构建了“SigIRR-TLR4-肠道屏障-菌群-胰腺炎症”的完整机制轴。 2. 研究模型系统全面：结合了临床样本（SAP患者腹水）、体外细胞屏障模型（Caco-2， HIEC）、体内基因修饰动物模型（AAV介导的肠道特异性过表达/敲低）以及肠道微生物组学分析，从多个层面验证了科学假设，证据链坚实。 3. 技术方法特色：成功筛选并应用了AAV10血清型实现小鼠肠道上皮细胞的高效、特异性基因递送，为在体研究肠道上皮特异性基因功能提供了可靠工具。 4. 临床关联性强：研究直接使用了SAP患者的腹水作为刺激物进行体外实验，使得研究发现更贴近人类疾病的真实病理环境，增强了转化医学意义。 5. 发现潜在治疗靶点：明确提出了SigIRR作为SAP治疗新靶点的潜力，为后续开发靶向SigIRR的药物或生物制剂奠定了坚实的理论基础。

七、 其他有价值内容 研究还观察到，不同病因（高甘油三酯血症性与胆源性）SAP患者的腹水对肠道上皮屏障的破坏能力存在差异（H-AF强于B-AF），尽管其炎症因子和內毒素水平无显著差异。这提示除常规炎症介质外，其他因素（如蛋白酶、活性氧、花生四烯酸代谢产物等）可能在H-AF引起的更严重肠道损伤中起作用，为进一步研究不同病因SAP的个性化病理机制提供了线索。此外，研究通过FISH技术直观地展示了SigIRR敲低后肠道细菌向黏膜固有层易位增加的现象，为“肠道屏障破坏-细菌易位”理论提供了直接的形态学证据。