本次向您介绍的是由多位研究人员合作完成的一项原创性基础医学研究。该研究论文题为“Activation of galanin receptor 1 with M617 attenuates neuronal apoptosis via ERK/GSK‑3β/Tip60 pathway after subarachnoid hemorrhage in rats”，由 Hui Shi（史慧）、Yuanjian Fang（方元健）等人共同署名，发表于 Springer 旗下期刊《neurotherapeutics》，于2021年5月14日被接受。主要研究机构包括中国重庆医科大学及其附属医院、浙江大学医学院第二附属医院，以及美国洛玛连达大学（Loma Linda University）的神经外科、生理与药理学系。本研究聚焦于神经科学和脑血管病领域，旨在探讨蛛网膜下腔出血（SAH）后早期脑损伤（EBI）的治疗新靶点。

研究的学术背景在于，蛛网膜下腔出血（SAH）是一种致死致残率极高的脑血管疾病。传统上，延迟性脑缺血是其不良预后的主要原因。然而，近年来学术界认识到，SAH发生后的72小时内发生的早期脑损伤（EBI）是决定患者预后的关键因素。在EBI复杂的病理机制中，神经元凋亡扮演着核心角色。因此，寻找能够有效抑制神经元凋亡的策略，是改善SAH患者预后的重要研究方向。甘丙肽（Galanin， GAL）是一种神经肽，通过其受体家族（包括GalR1、GalR2和GalR3）在中枢神经系统发挥多种生理和病理调控作用。既往研究表明，在缺血性中风模型中，激活甘丙肽受体1（GalR1）具有抗凋亡的神经保护作用。然而，GalR1在SAH后的作用及其机制尚不明确。同时，研究发现细胞外信号调节激酶（ERK）/糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）信号通路在细胞凋亡中至关重要，且GSK-3β可磷酸化激活Tat相互作用蛋白60（Tip60），进而促进p53介导的凋亡。基于此，本研究提出假设：在SAH后，通过选择性激动剂M617激活GalR1，可能通过调控ERK/GSK-3β/Tip60通路来抑制神经元凋亡，从而发挥神经保护作用。本研究的目的即在于验证这一假设。

本研究设计严谨，实验流程分为五个部分，共使用了248只成年雄性Sprague-Dawley大鼠。第一部分，确定内源性甘丙肽及其受体在SAH后的表达时程和细胞定位。将36只大鼠分为假手术组和SAH后不同时间点（3、6、12、24、72小时）组（每组n=6）。通过蛋白质印迹法检测同侧大脑半球中甘丙肽、GalR1、GalR2的蛋白表达水平。额外使用4只大鼠（假手术和SAH后24小时各2只），通过双重免疫荧光染色（标记神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞）观察GalR1在脑内的细胞共定位情况。第二部分，评估敲低GalR1或GalR2对SAH后神经元凋亡的影响。50只大鼠分为5组（每组n=10）：假手术组、SAH+PBS组、SAH+scramble CRISPR组、SAH+GalR1 CRISPR（敲低）组、SAH+GalR2 CRISPR（敲低）组。在SAH后24小时进行神经行为学评分（改良Garcia评分、平衡木测试）。每组随机选取6只进行蛋白质印迹，检测GalR1、GalR2以及凋亡相关蛋白p53、Bcl-2、Bax的水平。每组剩余的4只大鼠用于TUNEL染色和Fluoro-Jade C染色，以评估同侧脑半球的细胞凋亡和神经元变性情况。第三部分，评估GalR1选择性激动剂M617的短期神经保护效果。首先进行剂量探索：36只大鼠分为5组（每组n=6）：假手术组、SAH+PBS组、SAH+M617（8 μg/kg）、SAH+M617（24 μg/kg）、SAH+M617（72 μg/kg）。药物在SAH后1小时经鼻内给药，24小时后评估神经功能。根据结果选定最优剂量（24 μg/kg）用于后续实验。随后，验证延迟给药的临床意义：12只大鼠分为SAH+PBS（3小时给药）和SAH+M617（3小时给药）两组（每组n=6），在SAH后3小时给药，24小时后进行评估。另外12只大鼠（每组n=4）用于TUNEL和Fluoro-Jade C染色，评估M617的早期抗凋亡效果。第四部分，评估M617对长期神经功能的影响。30只大鼠分为假手术组、SAH+PBS组、SAH+M617组（每组n=10）。在SAH后第7、14、21天进行旋转棒测试评估运动协调能力，在第22-27天进行莫里斯水迷宫测试评估空间学习记忆能力。第28天处死大鼠，进行尼氏染色和Fluoro-Jade C染色，评估海马区的神经元变性。第五部分，阐明M617激活GalR1的神经保护机制。在第三部分基础上，额外纳入30只大鼠，分为5组（每组n=6）：SAH+M617+scramble CRISPR、SAH+M617+GalR1 CRISPR、SAH+M617+DMSO、SAH+M617+ERK抑制剂U0126、SAH+M617+GSK-3β激活型CRISPR。通过联合使用GalR1敲低质粒、ERK抑制剂或GSK-3β激活质粒，在给予M617的基础上阻断或激活特定信号节点。所有干预措施均在SAH前或SAH时进行。SAH后24小时，收集脑组织进行蛋白质印迹分析，检测GalR1、磷酸化ERK（p-ERK）、磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）、磷酸化Tip60（p-Tip60）、p53、cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白水平。本研究采用的SAH模型是经典的内血管穿刺法。数据分析主要采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验，长期数据采用双因素重复测量ANOVA。数据以均值±标准差表示，p<0.05被认为具有统计学意义。

本研究取得了系统性的重要结果。首先，在内源性表达方面，SAH后同侧大脑半球的内源性甘丙肽和GalR1蛋白表达均显著上调，分别于12小时和24小时达到峰值，而GalR2表达无显著变化。免疫荧光显示，GalR1主要表达于神经元，但也存在于部分星形胶质细胞和小胶质细胞中。这提示SAH后可能存在内源性的甘丙肽-GalR1神经保护机制。其次，功能缺失实验证实了GalR1的重要性。与假手术组或scramble对照组相比，CRISPR敲低GalR1（而非GalR2）显著加重了SAH后24小时的神经功能缺损，同时增加了TUNEL阳性细胞和Fluoro-Jade C阳性细胞数量。蛋白质印迹显示，GalR1敲低进一步加剧了SAH引起的促凋亡蛋白p53、Bax表达上调以及抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调。这些结果强有力地证明了内源性GalR1激活在SAH后具有抑制神经元凋亡、保护神经功能的作用。第三，功能获得实验验证了M617的治疗潜力。剂量探索发现，24 μg/kg的M617在SAH后1小时经鼻给药，能最有效地改善24小时后的短期神经功能评分。更重要的是，即使在SAH后3小时延迟给药，M617同样能显著减少神经元凋亡和变性，显示出临床转化的潜力。M617治疗显著下调了促凋亡蛋白p53、cleaved caspase-3和Bax的表达，同时上调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。第四，长期疗效评估显示，M617治疗显著改善了SAH后第7天和第14天的运动协调能力（旋转棒测试），并显著改善了第22-27天的空间学习和记忆能力（水迷宫测试）。组织学检查证实，M617治疗减少了SAH后第28天海马CA1区的神经元丢失和变性。第五，也是本研究最核心的部分，机制探究揭示了信号通路。SAH后，M617激活GalR1能够显著上调p-ERK和p-GSK-3β（即抑制GSK-3β活性）的水平，同时下调p-Tip60（Ser86位点磷酸化）的水平。与信号变化一致，下游的促凋亡通路（p53、cleaved caspase-3、Bax）被抑制，而抗凋亡蛋白Bcl-2上调。当使用GalR1 CRISPR敲低GalR1后，M617诱导的上述所有有益变化（p-ERK/p-GSK-3β/p-Tip60通路激活及抗凋亡效应）均被完全取消。同样，使用ERK抑制剂U0126阻断ERK活性，或使用CRISPR激活GSK-3β，也都能废除M617的神经保护作用和抗凋亡效应。这些结果形成了一个完整的证据链：M617通过激活GalR1，进而激活ERK；激活的ERK磷酸化并抑制GSK-3β的活性；被抑制的GSK-3β减少了对Tip60（Ser86）的磷酸化激活；被抑制的p-Tip60减弱了其对p53介导的凋亡通路的促进作用，最终减少了cleaved caspase-3的生成和神经元凋亡。这一“GalR1 → ERK → p-GSK-3β → p-Tip60 → 凋亡”的信号轴，在本研究中得到了多环节的验证。

本研究得出明确结论：在SAH大鼠模型中，使用选择性激动剂M617激活甘丙肽受体1（GalR1），能够有效改善短期和长期的神经功能缺损，其核心机制在于通过激活ERK/GSK-3β/Tip60信号通路，从而显著减轻神经元凋亡。GalR1是一个有前途的治疗SAH的潜在靶点。本研究的科学价值在于，首次系统阐明了GalR1在SAH后早期脑损伤中的保护作用及其下游的分子机制，为理解SAH病理生理学增添了新的重要内容。其应用价值在于，为开发以GalR1为靶点的新型神经保护药物提供了坚实的临床前实验证据，尤其是经鼻给药和延迟给药仍有效的特点，增强了其向临床转化的可行性。

本研究的亮点突出：第一，研究发现的创新性：首次揭示了GalR1在SAH中的神经保护作用，并原创性地将其与ERK/GSK-3β/Tip60这条凋亡调控通路联系起来，构建了一个新的信号调控网络。第二，研究设计的系统性与逻辑严密性：实验从内源性表达规律（现象）→ 功能缺失验证（必要性）→ 外源性激动剂治疗（有效性，含剂量和时效探索）→ 长期疗效评估 → 分子机制深入剖析（上下游通路验证），环环相扣，论证充分。特别是第五部分的机制研究，通过“激动剂+抑制剂/基因操作”的组合，对假设的信号通路进行了正向和反向的多重验证，说服力强。第三，临床转化潜力：研究不仅证明了早期给药的疗效，还特别设置了延迟（3小时）给药组并证实有效，同时采用了无创的经鼻给药方式，这些都更贴近临床SAH患者的实际治疗情境，提升了研究的应用价值。第四，技术方法的规范性：研究采用了SAH领域公认的动物模型、行为学测试和分子生物学检测方法，并详细报告了动物死亡率、排除标准等，符合ARRIVE指南，保证了结果的可靠性。

此外，作者在讨论中也坦诚了本研究的局限性，例如未探索M617的最佳治疗方案（如多次给药）、GalR1在胶质细胞中的作用未完全排除、以及可能还存在其他未被发现的信号机制等。这些为未来的研究指明了方向。总体而言，这是一项设计精良、执行严谨、结论可靠且具有重要转化意义的优秀基础医学研究。