关于“模块化骨类器官活体组装与原位引导血管化”研究的学术报告

第一， 研究的主要作者、机构、发表期刊及时间

本研究由来自中国多个顶尖研究机构的团队合作完成。第一作者包括Jingyi Ju、Huimin Fang、Junjin Jie和Yuezhou Wu。通讯作者为Houfeng Zheng、Jiaming Sun、Jiacan Su和Zhenxing Wang。参与机构包括：华中科技大学同济医学院附属协和医院整形外科；上海交通大学医学院附属新华医院骨科；上海大学转化医学研究院、Medeng-X研究所、国家转化医学中心上海大学分中心；苏州大学附属第二医院苏州精准健康与数据科学实验室；以及华中科技大学再生医学与多学科转化研究湖北省重点实验室。

该研究以题为“Modular living assembly of bone organoids with in situ guided vascularization”的论文形式，于2026年5月15日在线发表在学术期刊《Bioactive Materials》第64卷上。

第二， 研究的学术背景

本研究属于组织工程与再生医学领域，聚焦于类器官（Organoid）技术的临床应用转化。类器官作为一种能够在体外模拟组织结构和功能的3D细胞聚集体，为再生医学带来了革命性前景。然而，其临床转化面临两大核心挑战：一是对异质性类器官单元进行可控、有序组装以构建组织尺度结构的困难，导致空间组织性丧失和功能可重复性差；二是宏观尺度类器官构建体缺乏功能性血管网络，氧气和营养物质扩散受限，易引发中心坏死，且移植后难以与宿主血管系统快速有效整合，阻碍了其进一步成熟和功能发挥。

针对这些挑战，研究团队旨在开发一种创新的策略，以实现骨类器官的高通量、模块化组装，并同时解决其血管化难题。他们提出了“新类器官可视化与组装”（Neo-organoid Visualization and Assembly， NOVA）平台。该平台的核心目标是将生物打印技术与基于水凝胶的生物粘附组装相结合，构建具有定制化几何形状、并能在植入后实现原位引导血管化的组织尺度骨类器官移植物，最终实现血管生成与骨生成的时空耦合，促进骨类器官的成熟与功能化。

第三， 详细的研究流程

本研究是一个系统工程，包含材料开发、平台构建、体外验证和体内评估等多个紧密衔接的环节。

1. 新型生物墨水（GDMA）的合成与表征： * 研究材料： 以低温鱼皮明胶（Gelatin）为基底材料。 * 处理流程： 首先，通过酰胺化反应将多巴胺（Dopamine）接枝到明胶上，合成明胶-多巴胺（Gelatin-Dopamine， GD）。随后，将GD与甲基丙烯酰化试剂（2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐， AEMA）反应，最终获得具有双功能基团（邻苯二酚/儿茶酚，Catechol 和 甲基丙烯酰基，Methacrylate）的明胶-多巴胺-甲基丙烯酰胺（GDMA）水凝胶。 * 实验与方法： 采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振氢谱（1H NMR）验证化学修饰的成功。通过扫描电子显微镜（SEM）观察内部孔隙结构，并量化孔径分布。利用流变仪评估其打印适性（如线性粘弹区、结构恢复能力）。通过接触角测量评估亲水性。通过压缩测试、溶胀实验、降解实验评估其机械性能、稳定性和溶胀行为。通过剥离、搭接剪切和拉拔测试量化其界面粘附强度。此外，还评估了其生物相容性，将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）封装或接种在GDMA水凝胶中，通过活/死染色、CCK-8实验、细胞骨架染色（Phalloidin）和免疫荧光（如VE-cadherin）等手段评估细胞活力、增殖、铺展和功能。

2. NOVA平台的构建与3D打印/组装能力验证： * 研究材料： 制备好的GDMA生物墨水。 * 处理流程： 利用数字光处理（DLP）生物打印技术，以GDMA为基质，高通量打印各种形状的模块（包括实心模块和带管腔的模块）。 * 实验与方法： 开发了基于儿茶酚氧化交联的模块组装技术。将打印好的模块界面用低浓度过碘酸钠（NaIO4）处理，触发界面快速交联（约90秒内实现稳定粘合），实现“乐高式”的底部向上组装。为了验证平台的组装能力和可扩展性，研究团队打印并组装了多种复杂结构，包括厘米级的人体器官模型（如耳朵、肾脏、肝脏、脊柱）和微米级的仿生结构（如耳蜗、肾小球-肾小管复合体、肝小叶）。特别构建了具有分级、环形、三维可灌注的血管网络模型，以及由异质模块（标记不同荧光颗粒）组装的大型管状骨模型。使用结构相似性指数（SSIM）定量评估打印和组装的保真度。

3. 原位单向引导血管化策略的开发与验证： * 研究对象： 无细胞的GDMA模块组装体（J形空心管），以及在其管腔内预种植HUVECs的组装体。 * 处理流程与动物模型： 使用BALB/c裸鼠建立皮下植入模型。设计了四组实验：(1) 对照组：管腔内种植HUVECs，但不与宿主动脉连接；(2) 空白组（GDMA/MC）：模块管腔与宿主皮下微动脉连接，远端放置载有培养基的微冷冻凝胶（Microcryogel， MC）；(3) 实验组（GDMA/endo/MC）：管腔内预种植HUVECs（内皮化），再与宿主动脉连接，远端放置载培养基的MC；(4) 阳性对照组（GDMA/endo/MC-VEGF）：与实验组类似，但MC载有血管内皮生长因子（VEGF）。 * 实验与方法： 将构建体植入小鼠背部皮下，在预定时间点（5、7、14、21天）取材。通过立体显微镜观察血管生长情况。对取出的组织进行H&E染色、Masson三色染色、CD31和vWF免疫组化/免疫荧光染色，以评估宿主血管向植入体内部的生长、浸润密度、成熟度（如是否有平滑肌细胞覆盖，α-SMA染色）以及组织整合和胶原沉积情况。

4. 骨类器官模块的构建、体外成骨诱导与体内植入评估： * 研究材料： 封装了BMSCs的GDMA水凝胶模块。 * 处理流程： * 体外成骨： 将打印好的BMSCs-GDMA模块在成骨诱导培养基中培养长达21天。通过碱性磷酸酶（ALP）染色和活性定量、茜素红S（ARS）染色和钙沉积定量、以及qPCR检测成骨标志基因（ALP, Runx2, OCN, Col1a）的表达，评估骨类器官模块的成骨分化能力。 * 体内植入： 构建了两组用于体内植入的柱状组装体：非血管化组（仅由BMSCs骨类器官模块组装）；血管化组（在BMSCs骨类器官模块组装成的柱状体中心预留管腔，并在植入前对该管腔进行HUVECs内皮化处理）。将两组构建体植入裸鼠皮下。 * 实验与方法： * 宏观与力学观察： 定期观察并记录植入体外观变化。12周后，对取出的植入体以及作为对照的天然小鼠胫骨进行压缩力学测试，比较其力学性能。 * 显微结构分析： 在植入后不同时间点（4、8、12周）对植入体进行Micro-CT扫描和三维重建，定量分析骨体积分数（BV/TV）、骨矿物密度（BMD）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数量（Tb.N）。 * 组织学与免疫学分析： 对植入体进行H&E、Masson三色、EVG（弹性纤维）染色，评估组织形态、胶原沉积和血管结构。进行CD31/OCN（骨钙素）免疫荧光共染色，并通过组织透明化和光片显微镜成像进行3D观察，分析血管网络与成骨活动的空间关系。通过CD163/CD83免疫荧光双标评估巨噬细胞表型（M1/M2）极化。通过ELISA检测植入部位组织渗出液中的炎症因子（IL-1β, TNF-α, IL-6）水平。 * 转录组学分析： 对植入12周后的非血管化组和血管化组样本进行批量RNA测序（RNA-seq）。通过差异表达基因（DEGs）分析、基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，探究血管化对骨类器官在体内微环境、代谢和信号通路的全局性影响。并通过qPCR对关键基因（VEGFA, MEF2D, SOX5, SOX9）进行验证。

第四， 研究的主要结果

1. GDMA水凝胶的综合性能优异： 成功合成了GDMA，其兼具良好的打印性、适宜的孔隙结构（主要孔径30-50 μm利于细胞生长）、可控的降解速率和优异的生物相容性。最关键的是，其富含的儿茶酚基团赋予了材料强大的湿态界面粘附能力，经氧化剂（NaIO4）处理后能在模块间形成稳定、快速的粘合，这是实现“活体模块组装”的化学基础。体外实验证实，GDMA能支持HUVECs形成良好的单层内皮，并促进BMSCs与HUVECs之间的细胞通讯，加速内皮细胞迁移。

2. NOVA平台实现了复杂结构的可控组装： 利用DLP打印和儿茶酚介导的粘合，成功组装了从微米到厘米尺度、形状各异的复杂结构，包括可灌注的仿生血管网络和大型异质骨模型。模块间连接牢固，能承受一定机械力且无泄漏，证明了该策略在构建组织尺度工程化组织方面的可行性和灵活性。

3. 原位引导血管化策略有效促进了功能性血管网络的快速整合： 体内实验表明，单纯连接宿主血管（空白组）仅能导致纤维组织长入，血管稀疏。而在管腔内预种植内皮细胞（实验组） 能显著引导宿主血管向植入体内部进行单向、有序的生长，在14-21天内形成密集、成熟且具有分级结构的血管网络，血管内可见红细胞，证实了其灌注功能。添加VEGF（阳性对照组）虽能促进血管生长，但可能导致过度出芽和结构紊乱。因此，研究确定“内皮化管腔+宿主血管引导”是更优策略。

4. GDMA水凝胶支持骨类器官的形成与成熟： 封装在GDMA中的BMSCs在成骨诱导后，能有效进行成骨分化，表现为ALP活性升高、钙结节大量沉积以及成骨相关基因（ALP, OCN, Runx2）表达上调。有趣的是，即使在没有外源性成骨诱导的情况下，GDMA本身也表现出一定的成骨诱导特性（Runx2表达升高）。

5. 血管化显著增强了骨类器官在体内的存活、成熟与骨形成： * 宏观与力学： 植入12周后，非血管化组结构塌陷、呈苍白死骨样；而血管化组保持了预设的圆柱形结构，表面发生皮质骨样骨化，力学强度接近天然小鼠胫骨。 * Micro-CT与组织学： Micro-CT显示，血管化组在各个时间点的骨形成（皮质骨和松质骨）均显著优于非血管化组，BV/TV和BMD值更高。组织学证实血管化组有更活跃的成骨细胞活动、更丰富的骨基质沉积以及更好的宿主组织整合。3D免疫荧光成像清晰展示了丰富的微血管网络从植入的动脉长入骨类器官移植物，且成骨标志物OCN的信号与血管信号高度重叠，提示成骨与血管生成在空间上紧密耦合。 * 免疫微环境： 血管化组在植入早期（2周）表现出更低的IL-1β炎症水平，并且在整个过程中维持了更高的M2型（促修复型）巨噬细胞比例，表明血管化有助于营造一个更利于再生修复的免疫微环境。 * 转录组学： RNA-seq分析揭示，与非血管化组相比，血管化组的基因表达谱发生显著重编程。GO分析显示免疫反应、糖酵解、脂质代谢等通路富集。KEGG分析显示，血管化激活了与细胞外基质-受体相互作用、黏着斑、PI3K-Akt信号通路等相关的通路，同时也富集了Hippo、Wnt、MAPK等与骨形成相关的信号通路。关键基因如SOX9、SOX5、VEGFA、MEF2D等显著上调。蛋白互作网络分析将SOX9置于中心位置，连接了发育调控、炎症信号、ECM重塑和血管相关等多个过程，提示SOX9可能在血管化促进的骨成熟中起核心调控作用。这些结果从分子层面解释了血管化如何通过重塑生态位、调节代谢和激活关键信号通路来促进骨类器官的功能性成熟。

第五， 研究的结论与价值

本研究成功开发并验证了NOVA这一整合性策略，用于构建具有原位引导血管化能力的模块化活体骨类器官。其科学价值和应用意义在于：

1. 方法论创新： NOVA策略将模块化生物打印、界面生物粘附化学和原位血管引导有机整合为一个连续框架，为解决类器官技术向组织尺度升级时所面临的空间组装失控和血管化不足两大瓶颈问题提供了系统性的解决方案。
2. 材料平台价值： GDMA不仅是一种可打印的生物墨水，更是一种“界面生物墨水”，它同时满足了打印适性、组装粘附性、结构稳定性和生物相容性/诱导性等多重要求，是实现该策略的关键材料基础。
3. 生物学机制揭示： 研究证实，预构建的内皮化管腔结合宿主血管引导，不仅能提供灌注，更重要的是建立了一个“发育性导管”，实现了血管生成与骨生成的时空耦合。这种耦合不仅改善了存活，还通过传递血管源性信号、招募祖细胞和重塑微环境，主动驱动了骨类器官的进阶成熟和功能化。
4. 转化医学潜力： 该策略能够快速构建大型、形状可定制的管状骨移植物，并实现与宿主血管的快速连接，为修复大段骨缺损等临床难题提供了新的思路，展示了“一步式手术移植与快速灌注”的潜力。

第六， 研究的亮点

1. 整合性创新： 研究的核心亮点在于其系统性。它不是孤立地优化材料或放大类器官，而是创建了一个从模块制造、界面组装、血管化到体内成熟的全链条平台（NOVA），将工程学制造与生物学功能实现紧密结合。
2. “活体组装”概念： 利用儿茶酚化学实现含水活细胞模块的稳定、快速组装，将传统用于组织粘合的技术创造性转化为构建活体组织的“生物胶水”，实现了从“打印整体”到“组装模块”的范式转变。
3. 主动引导的血管化策略： 提出的“原位单向引导血管化”超越了传统的生长因子释放或内皮细胞共培养，通过预内皮化的管腔结构与宿主血管的手术连接，主动引导宿主血管沿特定方向长入，实现了更快、更有序、更功能化的血管整合。
4. 深入的多层次验证： 研究从材料表征、体外功能、动物模型表型（宏观、力学、影像、组织学）到分子机制（转录组学），进行了全面且深入的验证，逻辑链条完整，证据坚实。

第七， 其他有价值的内容

研究也客观指出了当前工作的局限性：目前的体内实验主要是在皮下异位植入模型中验证血管化促进成熟的概念，而非在承受力学负荷的原位骨缺损模型中评估功能性骨再生。因此，该研究为后续的转化研究奠定了坚实的生物学和工程学基础，但真正的临床应用仍需在大型动物（如羊、猪）的节段性骨缺损模型中进行进一步的功能性验证。此外，GDMA作为完全可降解支架，其降解与宿主组织长入、胶原沉积和支架替代的时间关联性也被观察到，这对其作为临时支架的临床应用具有积极意义。