本研究由吴一硕（yishuo wu）、姜光亮（guangliang jiang）、张宁（ning zhang）等为主要作者，由复旦大学附属华山医院泌尿外科、复旦大学泌尿外科研究所、上海交通大学医学院附属上海第一人民医院泌尿外科、上海交通大学医学院附属瑞金医院泌尿外科及美国NorthShore大学健康系统个性化癌症诊疗项目（Program for Personalized Cancer Care）等单位合作完成。论文发表于《European Urology Focus》第6卷第2期（2020年），页码284–291。

本研究的学术背景基于膀胱癌（bladder cancer, BCA）在全球范围内的高发病率与高死亡率。血尿（hematuria），包括肉眼血尿和镜下血尿，是膀胱癌最常见的临床表现。在血尿患者中，约3%–15%最终被诊断为尿路上皮癌，其中膀胱癌最为常见。膀胱镜检查（cystoscopy）是目前诊断膀胱癌的金标准，但其具有侵入性且费用较高；尿脱落细胞学检查虽然特异性较高，但对低级别肿瘤的敏感性不足。DNA甲基化（DNA methylation）是重要的表观遗传修饰，与包括膀胱癌在内的多种癌症的发生发展密切相关。由于尿路上皮肿瘤细胞可脱落到尿液中，因此尿液DNA甲基化检测具有无创或微创诊断膀胱癌的潜力。既往已有研究在欧美人群中建立了多种尿液甲基化标志物，但DNA甲基化状态可能受遗传背景、饮食习惯和生活方式等环境因素影响，因此有必要在中国人群中评价并验证这些标志物。本研究旨在开发和验证一组适用于中国血尿患者的尿液甲基化标志物组合，以提高膀胱癌的无创检测效能。

研究整体采用病例对照设计，分为两个阶段，即第一阶段为检测组合构建阶段，第二阶段为独立验证阶段。总体流程包括候选基因筛选、甲基化特异性高分辨率熔解曲线聚合酶链反应（methylation-specific high-resolution melting-curve polymerase chain reaction, MS-HRM PCR）检测方法的建立与优化、基因组合筛选及验证。

在候选基因筛选阶段，研究者首先在PubMed中以“bladder”“methylation”“urine”为关键词检索2000年至2016年的文献，共得到134篇文献。根据以下标准筛选研究：设计良好的病例对照研究或队列研究、样本量超过100、主要关注非肌层浸润性膀胱癌（non–muscle-invasive bladder cancer, NMIBC）、使用尿液DNA作为检测样本。最终纳入了14项符合标准的研究，共报告了38个基因。进一步筛选标准为：该基因在不同研究中被报告两次或以上，并且在基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）来源的数据库中，该基因在膀胱癌组织与非癌组织之间的甲基化水平差异达到p值小于5×10⁻¹⁰。最终筛选出5个基因（HOXA9、POU4F2、ZNF154、VIM和TWIST1），并额外纳入3个在膀胱癌及其他癌症研究中常用的基因（PCDH17、ONECUT2和PENK），共8个候选基因进入后续分析。

在样本收集阶段，研究共从复旦大学附属华山医院2015年至2016年间因肉眼或镜下血尿接受膀胱镜检查或经尿道膀胱肿瘤切除术（transurethral resection of bladder tumor, TURBT）的患者中收集了210份尿液样本。所有患者均为初诊患者，无尿路上皮恶性肿瘤病史。研究方案经华山医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。尿液样本在膀胱镜检查或手术前采集，经离心后收集细胞沉淀，用于后续DNA提取。8个基因启动子CpG岛或外显子区域的甲基化水平通过MS-HRM PCR方法进行定量分析。在甲基化检测与数据分析过程中，研究者对样本的临床表型信息设盲。

在基因panel构建阶段，共有192份尿液样本符合DNA提取与甲基化分析的质量要求，其中81份用于第一阶段panel选择，111份用于第二阶段独立验证。在81份第一阶段样本中，膀胱癌组44例，非膀胱癌对照组37例。对照组包括尿路结石、良性前列腺增生和尿路感染患者。对8个候选基因的甲基化检测结果进行单因素和多因素logistic回归分析，结果显示8个基因在单因素分析中均与膀胱癌显著相关；在多因素分析中，只有HOXA9、PCDH17、POU4F2和ONECUT2四个基因仍与膀胱癌独立相关。因此，这四个基因被纳入最终panel进行后续验证。研究者还建立了一种三级风险分层解读策略：阳性为3–4个基因甲基化，中间为1–2个基因甲基化，阴性为0个基因甲基化。

在第二阶段独立验证中，111份样本包括膀胱癌组53例，对照组58例。四个基因甲基化检测结果与临床诊断进行比较。结果显示，在第二阶段中，有27例患者被判定为阳性，这些患者全部为膀胱癌，阳性预测值（positive predictive value, PPV）为100%；阴性预测值（negative predictive value, NPV）为82.1%。将两个阶段数据合并后，总体PPV仍为100%，NPV为84.1%。研究者进一步评估，若将膀胱癌在一般血尿人群中的患病率设定为10%，则该组合检测的NPV可提高至98%。基于该组合检测的预测模型，受试者工作特征曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve, AUC）为0.871，敏感性为90.5%，特异性为73.2%。在一般血尿人群中，该检测组合能够准确预测超过一半的膀胱癌病例，并可避免约60%的不必要膀胱镜检查。

在四个基因单独检测性能方面，验证队列中HOXA9的敏感性为50.9%、特异性为93.1%；PCDH17的敏感性为47.2%、特异性为79.3%；POU4F2的敏感性为77.4%、特异性为79.3%；ONECUT2的敏感性为56.6%、特异性为91.4%。多因素logistic回归分析中，POU4F2与膀胱癌诊断显著相关（p=0.004），HOXA9、PCDH17和ONECUT2在调整年龄和性别后与膀胱癌诊断呈边缘相关。在肿瘤分级分层分析中，低级别与高级别膀胱癌的检出比例无显著差异（53.2% vs 55.8%，p=0.83）。6例低度恶性潜能的乳头状尿路上皮肿瘤（papillary urothelial neoplasm of low malignant potential, PUNLMP）中无一例被该检测判为阳性，但其中4例有1个基因甲基化阳性，属于中等风险层。在Tis或T1期肿瘤中，甲基化检测阳性加中间的比例（96.3%）高于Ta期肿瘤（85.5%）。

本研究结论认为，尿液联合甲基化检测组合HOXA9、PCDH17、POU4F2和ONECUT2在中国血尿患者中具有较高的PPV和NPV，能够有效区分膀胱癌与良性病变。通过三级风险分层解读，该检测组合能够在一般血尿人群中识别出超过一半的膀胱癌病例，同时避免约60%的低风险患者接受不必要的侵入性膀胱镜检查。该研究的科学价值在于为中国人群膀胱癌尿液甲基化标志物提供了新的验证数据；应用价值在于为血尿患者提供了一种无创或微创的膀胱癌辅助诊断工具，有望减少不必要的膀胱镜检查，降低患者痛苦和医疗费用。

本研究的亮点包括：第一，首次在较大样本量的中国血尿患者中开发并验证了HOXA9、PCDH17、POU4F2和ONECUT2四基因甲基化组合；第二，采用三级风险分层解读策略，使阳性结果达到100%的PPV，具有直接提示膀胱癌的临床价值；第三，阴性结果在一般血尿人群中具有较高的NPV，有助于排除恶性病变；第四，该研究采用MS-HRM PCR技术，具有较高的敏感性和特异性，且方法相对简便，适合临床推广。研究也存在一定的局限性：样本量相对较小，且为病例对照设计而非自然血尿队列研究，吸烟状况等潜在混杂因素未纳入分析。未来需要在大规模前瞻性队列中进一步验证该检测组合的性能。