本文属于类型b，即综述性科学论文。
本文作者为Kritika Gupta、Mruganka Parasnis、Ratnesh Jain和Prakash Dandekar，分别来自印度化学技术学院（Institute of Chemical Technology）药学科学与技术系和化学工程系。该综述发表于 Biotechnology Advances 第37卷（2019年），文章编号107415，于2019年7月1日收稿，2019年7月3日在线发表。
本文是一篇关于在哺乳动物细胞中提高单克隆抗体（mAbs）产量的载体工程策略的综述。文章系统梳理了表达载体中各类遗传元件的作用与优化方法，旨在为克服mAb生产中的细胞层面瓶颈提供理论参考与实践指导。全文围绕启动子选择、增强子与绝缘子、基质附着区等调控元件、内部核糖体进入位点（IRES）介导的轻重链比例优化、筛选标记系统、信号肽工程以及基因编辑和代谢工程等八个主要方面展开论述。
第一，启动子与增强子及绝缘子对转基因表达的调控。 作者首先指出，启动子是决定载体表达效率的关键因素。病毒启动子如人巨细胞病毒即刻早期启动子（hCMV-IE）和猿猴病毒40（SV40）启动子因其高表达而被广泛使用，但长期表达中易因DNA甲基化而发生转录沉默。相比之下，真核启动子如中国仓鼠延伸因子-1α（CHEF-1α）、人延伸因子-1α（hEF-1α）和人泛素C（UBC）启动子在长期培养中表现出更高的稳定性与均一性。作者进一步分析了启动子的核心结构元件，包括TATA盒、下游启动子元件（DPE）、起始元件（Inr）等，并指出启动子效率取决于增强子活性、TATA盒存在与否以及DPE的数量。在增强子方面，人巨细胞病毒增强子能够使荧光素酶表达提高100倍并持续100天以上，而鼠巨细胞病毒增强子仅能维持43天。绝缘子则通过两种方式发挥作用：一是作为屏障阻止异染色质的沉默扩散，二是阻断增强子对邻近基因启动子的作用。其中CTCF绝缘子和鸡β-珠蛋白基因座控制区高敏位点4（cHS4）是研究最为深入的两种绝缘子。
第二，基质附着区（MAR）和其他调控元件的应用。 作者指出，MAR是富含AT的DNA序列，长度约300至1500 bp，能够与核基质高亲和力结合，形成染色质环。MAR可作为转录因子如SATB1、SAF-A、HMGA-1等的结合平台，通过改变染色质构象来激活或优化基因表达。来自鸡溶菌酶基因的MAR在稳定整合事件中提高了产生重组抗体的克隆数量；来自人β-珠蛋白和β-干扰素基因的MAR与CMV启动子联用时，显著增强了EGFP在CHO细胞中的稳定表达。此外，稳定抗抑制元件（STAR）的尺寸更小（0.5至2 kbp），能有效抑制抗生素抗性基因的沉默。泛在染色质开放元件（UCOE）则通过含无甲基化CpG岛的双向启动子结构，使转基因处于转录活跃状态。研究比较发现，1.5 kb的A2UCOE元件在CHO细胞中使抗体产量提高六倍，优于MAR、STAR和cHS4等元件。作者还提到通过构建CHO-K1基因组文库发现了新的调控元件E77，其含有AP-1、E-box和GATA-1等转录激活因子结合位点。
第三，IRES驱动的轻重链比例优化。 单克隆抗体由两条重链（HC）和两条轻链（LC）通过二硫键连接而成。在双顺反子载体中，IRES使下游基因以不依赖帽结构的方式进行翻译。研究表明，将LC置于IRES上游、HC置于下游，可获得较高的LC/HC比例，从而有利于IgG的正确折叠与组装。过量的LC有助于将HC从免疫球蛋白结合蛋白（BiP）上释放，促进IgG单体的形成；而过量的HC则会引起内质网应激和细胞凋亡。研究显示LC/HC比例为1.5时产量最高。在三顺反子系统中，通过减弱筛选标记的表达强度，可以在更短时间内筛选出高表达克隆。病毒IRES中，脑心肌炎病毒（EMCV）IRES的效率最高，其第11个AUG密码子是蛋白质合成的主要起始位点。与弗林蛋白酶2A（F2A）元件相比，IRES载体产生的IgG聚集率仅为28%，而F2A载体为45%，表明IRES更适合于稳定mAb的生产。
第四，筛选标记基因的选择。 作者指出，筛选系统的严格程度直接影响重组蛋白的产量和克隆筛选效率。抗生素筛选标记如新霉素/G418、潮霉素、嘌呤霉素和杀稻瘟菌素虽然使用方便，但不能进行基因扩增，且易导致非表达克隆的生长。代谢筛选标记则具有更高的严格性。二氢叶酸还原酶（DHFR）系统通过甲氨蝶呤（MTX）的逐步加压实现基因扩增，使特定生产率提高10至20倍。谷氨酰胺合成酶（GS）系统由Lonza公司开发，通过甲硫氨酸亚砜亚胺（MSX）施加选择压力，并在无谷氨酰胺培养基中筛选，其优势在于所需基因拷贝数较低且能降低氨的积累。此外，次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）系统通过HAT培养基进行筛选，基因扩增速度更快，但仍有待进一步发展。
第五，信号肽工程对分泌效率的影响。 信号肽长度约为15至30个氨基酸，位于抗体N端，通过共翻译转运途径介导抗体进入内质网。信号肽由带正电的N端、疏水的H区和极性较大的C端组成。H区的疏水性决定了信号肽与信号识别颗粒（SRP）的结合亲和力。通过突变增加H区疏水性可提高重链产量。研究显示，过表达SRP14可改善CHO细胞中曲妥珠单抗和英夫利昔单抗的分泌。不同来源的信号肽对蛋白质产量的影响差异显著，从0.7 g/L到4 g/L不等。人白蛋白来源的信号肽表现最佳，白介素-2信号肽的优化可使碱性磷酸酶和内皮抑素的分泌量增加3.5倍。来自海洋生物Gaussia荧光素酶基因的信号肽在许多情况下优于白蛋白和IL-2来源的信号肽。同时要指出，异源物种来源的信号肽并非总能提高产量，如来自酵母杀伤毒素K28的信号肽在CHO细胞中表现不佳。信号肽的剪切准确性也至关重要，剪切位点的变异会导致mAb的截短或延长，改变其亲和力。
第六，基因编辑工具与代谢工程的应用。 近年来，锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）和成簇规律间隔短回文重复（CRISPR）/Cas9等基因编辑工具被引入载体工程。ZFN介导的DHFR敲除CHO-S细胞在DHFR筛选系统下表现出比野生型更高的mAb表达水平。TALEN被用于本氏烟中利妥昔单抗的N-糖基化修饰，成功敲除了两个岩藻糖基转移酶（FucT）基因和两个木糖基转移酶（XylT）基因，显著降低了α(1,3)-岩藻糖和β(1,2)-木糖水平。CRISPR/Cas9介导的位点特异性整合在CHO基因组中实现了高达34%的精确整合效率，显著高于传统随机整合。在代谢工程方面，过表达转录因子XBP-1、ATF4和GADD34可增强分泌途径能力。糖工程方面，通过敲除FUT8基因或过表达细菌氧化还原酶RMD，可获得无核心岩藻糖的IgG，增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。唾液酸化修饰则通过共表达人源半乳糖基转移酶（GT）和ST6唾液酸转移酶实现，使曲妥珠单抗的α2,6-唾液酸化水平提高40%，延长了抗体的体内半衰期。此外，在CHO细胞中异源表达酵母丙酮酸羧化酶2（PYC2）可降低乳酸积累，同时使抗体的半乳糖基化组成提高三倍。
本文的学术价值在于系统整合了mAb生产载体设计的多个层面，将启动子、增强子、绝缘子、MAR、UCOE、IRES、筛选标记、信号肽及基因编辑工具等要素都置于同一框架下进行梳理与比较。这为从事重组抗体生产的科研人员和工业界人士提供了从载体构建到克隆筛选再到产品质量控制的完整技术视角。尤其值得关注的是，文章强调了轻重链比例优化和信号肽选择这两个在细胞层面容易被忽视的瓶颈，并指出仅仅提高基因拷贝数并不一定能提高蛋白产量，因为宿主细胞的分泌和折叠能力同样构成限制因素。这一观点有助于推动研究者从单纯的表达增强转向对分泌途径和代谢网络的系统优化。文章所综述的多种策略在CHO、NS0和HEK293等主要表达平台中的适用性也为工艺开发提供了实用指导。