本研究由意大利都灵大学药物科学与技术系的Patrizia Rubiolo教授和临床与生物科学系的Manuela Donalisio教授联合通讯，第一作者为Stefano Acquadro和Andrea Civra，合作单位还包括卡利亚里大学环境与生命科学系及都灵大学生命科学与系统生物学系。该研究于2020年9月16日在线发表于期刊 *Planta Medica*（2020年第86卷，第1363–1374页），DOI为10.1055/a-1232-5705。

寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）是一种经节肢动物传播的黄病毒科（Flaviviridae）病毒，主要通过热带和亚热带地区的埃及伊蚊（*Aedes aegypti*）叮咬传播。ZIKV感染在成人中可导致格林-巴利综合征（Guillain-Barré syndrome）和脑膜脑炎等严重神经系统疾病，在孕妇感染时还可引起新生儿小头畸形（microcephaly）等先天性畸形。目前尚无美国食品药品监督管理局（FDA）批准的特异性抗病毒药物或疫苗，临床治疗仅为对症支持。因此，开发新的有效预防和治疗策略十分迫切。药用植物作为天然抗ZIKV活性成分的重要来源，尤其是多酚类和生物碱类化合物，成为极具潜力的补充与替代策略。石榴（Punica granatum L.，千屈菜科Lythraceae）是一种在民间医学中广泛应用的古老植物，其果实、果皮、树皮、叶片和花等部位均富含多酚。已有研究表明石榴果实提取物对单纯疱疹病毒2型（HSV-2）、人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和流感病毒具有抑制作用，但关于石榴叶提取物的抗病毒研究报道较少。本研究旨在系统研究石榴叶乙醇提取物、其分级组分及单体化合物的组成、细胞毒性和抗ZIKV活性，明确其活性成分并初步阐明作用机制。

研究工作的流程包括以下几个主要环节。首先，研究团队从意大利撒丁岛、其他意大利地区及希腊的不同地点于2017年和2018年的夏季与秋季采集石榴叶片样本，其中样本8来自卡利亚里大学植物园。所有样本经40°C烘干至恒重后，用乙醇超声提取制备粗提物。以参考石榴叶乙醇提取物PGL8为对象，通过病毒空斑减少实验评估其对非洲谱系ZIKV株MR766的抗病毒活性，结果显示提取物在感染前、感染期间及感染后均能剂量依赖性地减少病毒空斑数，半数有效浓度（EC₅₀）为11.4 µg/mL，半数细胞毒性浓度（CC₅₀）为123.6 µg/mL，选择性指数（SI）为10.84。为排除溶剂干扰，实验中设置了DMSO/H₂O溶剂对照。此外，提取物对DNA病毒HSV-2也显示出明显抑制作用（SI为47.08），但对痘苗病毒（VACV）无抑制作用，表明其抗病毒活性具有一定特异性但并不局限于RNA病毒。通过对提取物的HPLC-PDA-MS/MS和GC-MS分析，共鉴定出酚类、黄酮类和五环三萜类等不同类别的次生代谢产物，其中鞣花酸（ellagic acid）含量最高，木犀草素、芹菜素和槲皮素的糖苷类为代表性黄酮成分，三萜类包括齐墩果酸、白桦脂酸和熊果酸。为保证提取物质量一致性和活性可重复性，研究还比较了来自不同地点、不同季节和不同年份叶片的植物化学成分及生物分子指纹，并采用DNA条形码技术对核糖体DNA内转录间隔区（ITS）和叶绿体psbA-trnH基因区域进行扩增和测序，结果显示各样本ITS序列与数据库中石榴序列一致性为100%至96.89%，psbA-trnH序列一致性为100%至97.64%，证明该物种在意大利境内遗传上高度稳定。基于这些结果，研究团队将夏季和秋季叶片提取物合并，分别命名为PGSUM和PGAUT，进行固相萃取（SPE）分级，得到以甲醇/水85:15洗脱的酚类组分（PGSUM85、PGAUT85）和以95:5洗脱的三萜类组分（PGSUM95、PGAUT95）。抗病毒筛选显示，两种酚类组分均对MR766株具有抑制作用，EC₅₀分别为16.20 µg/mL和10.40 µg/mL，而三萜类组分无活性。进一步对酚类和三萜类组分中的主要单体化合物在3.7、11和33 µg/mL三个浓度下进行抗ZIKV活性初筛，结果显示只有鞣花酸呈剂量依赖性地抑制ZIKV感染，在33 µg/mL（109.2 µM）时感染率降至0%，而芹菜素、木犀草素、芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷及三种三萜酸均无抑制作用。研究随后利用制备型液相色谱从PGAUT85组分中分离得到鞣花酸单体，经¹H NMR鉴定并与商业标准品比对，HPLC-PDA测定纯度大于97%。对分离得到的鞣花酸进行了更广泛的浓度范围测试，其对MR766株的EC₅₀为30.86 µM，对亚洲谱系ZIKV株HPF2013的EC₅₀为46.23 µM，商业鞣花酸标准品对两株病毒的EC₅₀分别为36.22 µM和20.99 µM，表明鞣花酸具有广谱抗ZIKV活性。免疫荧光实验进一步证实，鞣花酸在109.2 µM时能完全抑制两种病毒株的蛋白E表达，在36.4 µM时感染细胞数量显著减少。

在机制研究方面，病毒产量降低实验显示，109.2 µM和36.4 µM的鞣花酸分别使MR766和HPF2013的感染性子代病毒产量降低约100倍和10倍。病毒灭活实验中，将鞣花酸与病毒在4°C或37°C共孵育2小时后未观察到直接灭活作用，排除了鞣花酸直接作用于病毒颗粒的可能。时间-加入实验（time-of-addition assay）表明，鞣花酸在感染前处理细胞时可剂量依赖性地抑制MR766株（EC₅₀=74.48 µM）和HPF2013株（EC₅₀=93.01 µM）的感染，但在感染期间加入无抑制作用，感染后加入仅有弱抑制作用，提示其主要通过改变细胞表面状态降低细胞对病毒感染的易感性。结合实验进一步证明，鞣花酸并不抑制病毒与宿主细胞表面的结合，暗示其可能通过掩蔽细胞表面的ZIKV受体（如AXL）或其他细胞表面分子而发挥作用，而非阻断病毒吸附过程。综合上述结果，鞣花酸主要的抗病毒机制并非直接灭活病毒，也不是干扰病毒吸附或早期胞内复制步骤，而可能是通过修饰细胞表面、降低细胞易感性来阻止病毒感染。

本研究首次证明了石榴叶乙醇提取物及其酚类组分具有体外抗ZIKV活性，并明确鞣花酸为主要活性成分。鞣花酸对非洲谱系和亚洲谱系ZIKV均显示出抑制感染和减少子代病毒产生的能力，这为其作为预防和治疗ZIKV感染的候选化合物提供了实验依据。该研究的科学价值在于：一方面扩展了石榴叶这一可持续利用植物资源的生物活性谱，证明了其植物化学组成在不同地理来源和季节间具有高度稳定性；另一方面，首次揭示了鞣花酸对黄病毒科ZIKV的抗病毒活性及其潜在作用机制。应用价值方面，鞣花酸作为天然多酚类化合物，具有较好的安全性记录和多种已知药理活性，其预防性抑制ZIKV感染的能力提示其可能用于阻断病毒经母婴垂直传播的链式过程，为开发新型抗ZIKV预防或治疗药物提供了有价值的先导化合物。研究亮点包括：首次报道了石榴叶提取物和鞣花酸对ZIKV的抑制作用；采用植物化学分析结合DNA条形码技术对石榴叶进行质量控制；通过系统的抗病毒实验方法（包括空斑减少实验、病毒灭活实验、时间-加入实验、病毒产量降低实验和结合实验）阐明了鞣花酸的主要作用环节。此外，研究也指出鞣花酸的选择性指数相对有限，未来可能需要通过结构修饰来进一步提高其安全窗口，并需要进一步研究其是否通过调节宿主先天免疫反应而间接发挥抗病毒作用。