本文系由Shahmir Naseer、Laura Abelleira-Hervas、Dhwani Savani、Ross de Burgh、Robertas Aleksynas、Cornelius K. Donat、Nelofer Syed和Magdalena Sastre等作者共同完成，其中通讯作者为伦敦帝国理工学院脑科学系的Magdalena Sastre博士。该研究于2022年10月11日发表在开放获取期刊《Biomolecules》（2022年第12卷，文章号1457）上，题为“创伤性脑损伤导致挫伤皮层中涉及痴呆的微小RNA发生改变”。
这项研究属于神经科学与分子生物学的交叉领域，重点关注创伤性脑损伤（Traumatic Brain Injury, TBI）与阿尔茨海默病（Alzheimer‘s Disease, AD）之间的潜在病理联系。研究的发起源于一个重要的临床观察：头部创伤是AD的重要环境风险因素，有TBI病史会加速AD的发病。尽管在TBI患者的尸检大脑中观察到β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块和Tau蛋白聚集，但TBI导致AD神经病理学的具体机制仍不清楚。本研究旨在探索这一机制，假设局部TBI会诱导损伤区域及其周围微小RNA（miRNA）表达的改变，进而影响与神经变性和AD病理相关基因的表达。研究的具体目标在于，通过动物模型，确定TBI后大脑中特定miRNA（尤其是那些与痴呆/AD相关的miRNA）的表达变化，并探索这些变化是否与AD关键病理蛋白（如Aβ和磷酸化Tau）的产生以及神经炎症过程相关联。
详细的研究流程如下： 1. 动物模型与组织准备： 研究采用成年雄性Sprague Dawley大鼠，使用控制性皮层撞击（Controlled Cortical Impact, CCI）模型来模拟中度至重度TBI。实验组大鼠在立体定位框架下接受撞击（参数：速度2.5 m/s，深度3 mm，持续时间100 ms），对照组为未受伤的Naïve大鼠。所有动物在手术后两周被处死，通过心脏灌注获取脑组织。损伤同侧（ipsilateral）包含挫伤区域的皮层组织、对侧（contralateral）相应皮层组织以及对照组相应脑区被分别收集并快速冷冻于-80°C，用于后续分子生物学分析。此外，研究还利用了团队既往一项类似严重度CCI研究（冲击器参数略有不同）中获取的石蜡包埋脑切片进行免疫组织化学分析。
2. miRNA表达谱筛选与分析： 首先，研究人员使用miRNeasy miRNA分离试剂盒从上述脑组织样本中提取总RNA，并富集小RNA。随后，他们采用商品化的miScript miRNA PCR阵列（针对神经系统发育与疾病相关的miRNA）对CCI大鼠损伤同侧皮层与对侧皮层样本进行比较，筛选出表达差异显著的miRNA。该阵列技术基于SYBR Green染料的实时定量PCR（qPCR），可以同时检测大量特定miRNA的表达水平。为验证阵列结果，研究者选取了与AD病理相关的几个候选miRNA（包括miR-9, miR-29b, miR-34a, miR-106b, miR-181a, miR-107），使用miScript SYBR Green PCR试剂盒对来自CCI大鼠（同侧、对侧）和Naïve大鼠的样本进行独立的qPCR验证，并以内参基因（如hs-snord61）进行标准化。
3. mRNA表达水平分析： 为了探究miRNA变化对下游靶基因的影响，研究对同一批脑组织样本进行了mRNA水平的qPCR分析。他们检测了与AD病理密切相关的基因，包括：β-位点淀粉样前体蛋白裂解酶1（BACE1）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、淀粉样前体蛋白（APP）、微管相关蛋白Tau（MAPT），以及一些神经炎症标志物（肿瘤坏死因子-α TNF-α、白细胞介素-6 IL-6、白细胞介素-4 IL-4、趋化因子CX3CL1）。使用QuantiFast SYBR PCR试剂盒，并以内参基因GAPDH进行标准化。
4. 免疫组织化学与形态学分析： 为了在细胞和组织层面验证分子生物学结果并观察病理改变，研究对CCI和Naïve大鼠的脑切片进行了系统的免疫组织化学染色。使用的抗体包括：标记小胶质细胞的离子钙接头蛋白1（Iba-1），标记星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白（GFAP），标记神经元的神经元核抗原（NeuN），以及标记磷酸化Tau蛋白（位点为Ser202）的CP13抗体。所有切片使用Axio成像仪扫描，并采用专业的HALO图像分析软件进行定量分析。对于小胶质细胞，软件量化了单位面积内的细胞数量以及每个细胞平均的突起面积（以评估激活状态）；对于星形胶质细胞，量化了细胞数量和GFAP阳性区域百分比；对于神经元，则量化了单位面积内的神经元数量；对于p-Tau，测量了阳性染色的区域百分比。
5. 数据处理与统计分析： 所有qPCR数据采用2^(-ΔΔCt)方法进行相对定量分析。数据比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）或双因素方差分析（Two-way ANOVA），并根据需要进行事后检验（Tukey多重比较检验）或学生t检验。显著性水平设定为p < 0.05。数据以均值±标准误表示。分析工具为GraphPad Prism 8软件。
研究取得的主要结果如下： 1. TBI改变了与痴呆相关的miRNA表达： miRNA阵列分析显示，与对侧皮层相比，CCI大鼠挫伤周围皮层中有多个与神经系统疾病相关的miRNA表达发生改变。进一步的qPCR验证确认了这些变化：在损伤同侧皮层中，miR-9的表达显著上调，而miR-29b、miR-34a、miR-106b、miR-181a和miR-107的表达则显著下调。这些变化均是与Naïve对照组比较得出的统计学显著结果。这些miRNA此前均被报道与AD病理过程相关，例如miR-29b和miR-107可调控BACE1，miR-106b参与抑制Tau磷酸化，miR-9和miR-181a与神经炎症和胶质细胞激活有关。
2. TBI影响AD相关基因的mRNA水平： 与下调的miR-29b和miR-107（已知为BACE1的负调控因子）相一致，研究发现在CCI大鼠损伤同侧皮层中，BACE1的mRNA表达水平显著上调了63%。同样，参与Tau磷酸化和Aβ生成的GSK3β的mRNA表达也上调了62%。然而，APP和MAPT（Tau）的mRNA水平未发生显著变化。在神经炎症方面，促炎因子TNF-α的mRNA表达在损伤同侧皮层急剧增加了405%，IL-6也有上升趋势（未达显著），而抗炎因子IL-4和趋化因子CX3CL1（Fractalkine）则呈下降趋势。
3. TBI诱导胶质细胞激活、神经元丢失和Tau蛋白磷酸化增加： 免疫组化结果直观地展示了病理改变。损伤后两周，在损伤同侧皮层（特别是挫伤周围区域）观察到明显的小胶质细胞和星形胶质细胞激活：Iba-1阳性细胞密度显著增加，细胞形态由静息时的分支状转变为激活态的胞体肥大、突起变短变粗甚至阿米巴样；GFAP阳性细胞密度和阳性区域面积也显著增加，形成胶质疤痕。在神经元方面，损伤同侧皮层出现显著的神经元丢失，而海马区CA1和CA3区域的神经元数量未见明显减少。最重要的病理发现之一是，尽管总Tau（MAPT）的mRNA未变，但磷酸化Tau（p-Tau， Ser202）蛋白在损伤同侧皮层的表达显著增加，而在海马区无显著变化。BACE1的蛋白水平在此时点未检测到明显变化。
本研究的结论是，在中重度TBI后两周，大脑挫伤区域发生了特定的miRNA表达谱改变，这些miRNA与AD的发病机制密切相关。这些miRNA的变化（如miR-29b和miR-107的下调）伴随着下游靶基因（如BACE1和GSK3β）表达的上调，并同时存在显著的神经炎症、胶质细胞激活、神经元丢失以及Tau蛋白过度磷酸化等病理特征。因此，该研究结果表明，TBI后的继发性损伤级联反应影响了调控AD相关基因表达的miRNA网络，这为理解TBI如何增加未来患AD的风险提供了一个新的分子机制框架。该发现不仅具有重要的科学价值，阐明了表观遗传调控（特别是miRNA）在连接环境风险因素（TBI）与神经退行性疾病（AD）之间的桥梁作用，而且具有潜在的转化应用价值：这些特异性改变的miRNA可能作为预测TBI后认知衰退或AD风险的生物标志物；同时，针对这些miRNA（如使用模拟物或抑制剂）或它们下游靶点（如GSK3β）的干预策略，可能成为预防或延缓TBI后AD病理发展的新型治疗靶点。
本研究的亮点在于： 1. 机制探索的深入性：研究没有停留在现象观察，而是系统地从表观遗传（miRNA）、基因表达（mRNA）、蛋白表达与修饰（p-Tau）、细胞病理（胶质激活、神经元丢失）等多个层面，构建了TBI诱导AD样病理改变的潜在信号通路。 2. 研究设计的严谨性：研究采用了同侧与对侧脑组织、受伤与未受伤动物的多重对照，并结合了高通量筛选（miRNA阵列）和靶向验证（qPCR）的策略，确保了结果的可靠性。 3. 发现的潜在转化意义：明确指出了特定miRNA（如miR-29b家族、miR-107等）在TBI-AD关联中的核心调控作用，为开发基于miRNA的诊断和治疗工具提供了直接的理论依据。 4. 模型与时间点的选择：使用经典的CCI模型模拟局灶性中重度TBI，并选择损伤后两周这个急慢性过渡期进行研究，有助于捕捉继发性损伤和神经退行性过程的早期分子事件。
此外，论文在讨论部分还详尽地将本研究发现与既往关于TBI和AD中miRNA变化的研究进行了对比和整合，强调了不同损伤模型、时间点和脑区可能带来miRNA表达谱的差异，并进一步阐释了每个特定miRNA（如miR-9、miR-181a、miR-34a、miR-106b）在神经炎症、细胞存活、Tau代谢等方面的已知功能，从而加强了本研究发现结果的生物学合理性和重要性。作者也坦诚指出了研究的局限性，例如BACE1蛋白水平在此时点未发生变化，提示其表达调控可能存在更复杂的时间动力学。总体而言，这项研究为理解“脑外伤如何埋下痴呆种子”这一重要临床问题贡献了重要的分子证据和新视角。