类型a：原创性研究报告
一、研究团队与发表信息
本研究由Han Fang、Mengling Shi、Cong Wang、Saiting Zhang等共同完成，通讯作者为Shuai Xu（中国农业科学院兰州兽医研究所）和Caoqi Lei（武汉大学）。研究团队来自武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室、湖北省细胞稳态重点实验室等多个机构。论文于2025年2月18日发表于PNAS（Proceedings of the National Academy of Sciences）第122卷第8期，标题为《PCSK9通过抑制AIP4介导的VISA/MAVS多聚泛素化和降解增强RNA病毒先天免疫应答》（PCSK9 potentiates innate immune response to RNA viruses by preventing AIP4-mediated polyubiquitination and degradation of VISA/MAVS）。
二、学术背景与研究目标
科学领域：该研究属于免疫学与病毒学交叉领域，聚焦于宿主抗病毒先天免疫反应的调控机制。
研究背景：
1. VISA/MAVS（Virus-induced signaling adaptor/Mitochondrial antiviral-signaling protein）是RNA病毒触发I型干扰素（IFN）信号通路的关键接头蛋白，其稳定性通过泛素化修饰动态调控。已知E3泛素连接酶（如AIP4）介导VISA的K48多聚泛素化降解，但上游调控机制尚不明确。
2. PCSK9（Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9）是胆固醇代谢的关键蛋白，其分泌形式通过降解LDLR（低密度脂蛋白受体）调控血脂。近年研究发现PCSK9在细菌感染和HCV（丙型肝炎病毒）中具有免疫调节作用，但对其细胞内功能知之甚少。
研究目标：揭示PCSK9在RNA病毒先天免疫中的双重作用机制，包括分泌形式的抗病毒效应和细胞内形式对VISA/MAVS通路的调控。
三、研究流程与方法
研究分为以下关键步骤：
1. PCSK9调控先天免疫通路的筛选与验证
- 实验对象：利用CRISPR/Cas9技术构建PCSK家族成员（PCSK2/5/6/8/9）敲除的HepG2细胞系。
- 方法：通过SeV（仙台病毒）感染，检测IFN-β转录水平（RT-qPCR）。结果显示PCSK9敲除显著抑制IFN-β诱导，而其他成员敲除效果相反。
- 特异性验证：过表达PCSK9增强SeV触发的IFN-β启动子、NF-κB和ISRE报告基因活性，但对IRF1启动子（IFN-γ触发）无影响，证实其特异性。
2. 细胞内与分泌型PCSK9的功能解析
- 突变体构建：设计催化失活突变体PCSK9（S386A），阻断其自剪切和分泌。实验显示该突变体比野生型更显著增强IFN-β诱导，表明细胞内PCSK9起主要作用。
- 分泌型功能：添加重组PCSK9（rPCSK9）或中和抗体Evolocumab（靶向分泌型PCSK9）均不影响poly(I:C)触发的IFN-β通路，但抑制VSV（水泡性口炎病毒）和SeV的附着与内化，依赖LDLR降解。
3. PCSK9缺失对病毒感染的体内外影响
- 体外实验：PCSK9敲除细胞中，SeV、VSV和EMCV（脑心肌炎病毒）触发的IFN-β和炎症因子（IL-6、RANTES）表达降低，而HSV-1（单纯疱疹病毒）无变化。病毒复制（GFP-VSV、SARS-CoV-2假病毒）显著增强。
- 体内实验：PCSK9−/−小鼠感染VSV或H7N9（甲型流感病毒）后，血清IFN-β和IL-6水平降低，器官病毒载量升高，死亡率增加；但HSV-1感染无差异。
4. PCSK9与VISA/MAVS互作机制
- 互作验证：Co-IP和体外GST pull-down证实PCSK9直接结合VISA，且病毒感染后其线粒体定位增强。结构域分析显示VISA的跨膜域和PCSK9的催化域为关键互作区域。
- 调控机制：PCSK9竞争性抑制E3连接酶AIP4与VISA结合，阻断K48多聚泛素化降解。在AIP4敲除细胞中，PCSK9过表达不再增强IFN-β信号，证实其依赖AIP4的调控路径。
四、主要结果与逻辑链条
1. 功能发现：PCSK9通过分泌形式（抑制病毒进入）和细胞内形式（稳定VISA）双重抗RNA病毒。
2. 机制解析：
- 线粒体定位：病毒感染促进PCSK9转位至线粒体，与VISA共定位。
- 竞争性抑制：PCSK9通过C端结合AIP4，催化域结合VISA，阻断AIP4介导的VISA降解。
3. 表型验证：PCSK9−/−小鼠对RNA病毒易感性增加，但DNA病毒无变化，证实其通路特异性。
五、研究结论与价值
1. 科学意义：首次揭示PCSK9作为VISA/MAVS通路的正调控因子，拓展了其在免疫代谢交叉领域的功能认知。
2. 应用潜力：
- 抗病毒治疗：靶向PCSK9的催化活性或可开发新型广谱抗RNA病毒药物。
- 临床权衡：现有PCSK9抑制剂（如降脂药）可能增加RNA病毒感染风险，需权衡利弊。
六、研究亮点
1. 双重功能：同一蛋白在细胞内外发挥截然不同的抗病毒机制。
2. 新颖机制：发现PCSK9通过竞争E3连接酶调控先天免疫通路。
3. 转化意义：为代谢-免疫互作提供了直接证据，提示病毒感染中需关注宿主代谢状态。
七、其他价值
研究还发现PCSK9对SARS-CoV-2假病毒复制有抑制作用，为COVID-19的宿主因子研究提供了新线索。数据公开于PNAS补充材料，支持进一步机制探索。