Frank Luechau（对应作者，现隶属于B.Braun Melsungen AG，德国）、Tau Chuan Ling（马来亚大学Institute of Biological Sciences, Faculty of Science）、Andrew Lyddiatt（Newcastle University, Business School），这项研究发表于 Food and Bioproducts Processing 杂志上的2011年第89卷（322-327页）。文章标题为《Recovery of B19 Virus-Like Particles by Aqueous Two-Phase Systems》，研究集中在使用水两相体系（Aqueous Two-Phase Systems, ATPS）回收B19病毒样粒子（virus-like particles, VLP）的新型方法。

学术背景

病毒样粒子（VLPs）是近年来生物技术领域的一个重要研发方向，其在基因传递载体、诊断技术及疫苗开发等领域具有广泛应用价值（Enders et al., 2007; Vicente et al., 2008; Young et al., 2006）。然而，VLP回收和纯化的下游处理过程通常受到其胞内或胞外产物特性、本体大小、多样性及结构稳定性的限制。例如，对于胞外VLP，通常可通过低速离心或过滤移除细胞并进一步利用可扩展技术如超滤或层析法纯化。但胞内VLP因需要从细胞释放并与细胞碎片分离，其回收显得更为复杂。此外，传统方法通常会导致显著的产物损失（Hart et al., 1994; Middelberg et al., 2000）。研究作者指出，基于ATPS的回收方式或能提供一种高效的替代方法。

本研究以一种ATPS为基础设计了两种创新的B19病毒样粒子回收工艺，希望能提高整体回收率，从而改善当前回收技术的经济效益。

研究流程

该研究包括以下主要流程和对象：

1. 对象选择：目标物为通过杆状病毒表达系统生产的B19病毒样粒子，其病毒壳体包含VP1（83 kDa）和VP2（58 kDa）两种蛋白质，直径范围为18-26 nm。供试样品由MedImmune Inc.提供，包括昆虫细胞浆和部分纯化的B19 VLP溶液。

2. 实验设计与水两相体系选择：实验采用聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）和硫酸镁作为两相形成体系的主要构成成分。研究者调整了PEG的分子量（PEG 1000）和硫酸镁浓度，并选择了特定的pH值（如pH 4.0）以优化VLP的回收效率。

3. 实验步骤与操作：

   • 第一种回收工艺：实验对象为来自破碎细胞的粗细胞裂解液。研究者在分相前通过短时超声处理支持VLP释放，并将其以10%湿重浓度溶解形成含PEG 1000和硫酸镁的水两相系统。样本经1200 x g离心提取后分别对两相（上相与下相）、界面及沉淀部分进行了化学分析。
   • 第二种回收工艺：实验对象为澄清后的细胞裂解液。调整后的ATPS体系包含PEG 1000、硫酸镁及一定量的氯化钠（NaCl）。加入NaCl的目的是通过改变相体积比来使VLP更多地分布到界面。

4. 数据处理与分析：采用BCA蛋白测定法估算总蛋白浓度，采用SDS-PAGE（凝胶电泳）法测量VP1及VP2的具体浓度，通过比色定量分析和光密度分析计算其分布比例。实验严格遵循重复试验设计，误差估算±5%。

主要实验结果

1. 第一种工艺的研究结果：

   • VP1和VP2蛋白在底相的回收率分别为92.8%和85.7%；
   • 上相、界面与沉淀主要含有细胞碎片与溶解总蛋白的31%；
   • 由于VP1和VP2大量集中于底相，研究者认为此法可减少后续操作中病原体的损失，并具有一定的工业化应用潜力。

2. 第二种工艺的研究结果：

   • VP1在界面的浓度高达95.3%，随后可通过界面再悬浮提高纯度；
   • VP2蛋白部分分布于上相，这表明非组装的VP2壳体蛋白可以在该工艺中高效移除，从而减少后续纯化的复杂性。

3. 总蛋白分布： 不同实验条件下，VP1和VP2浓度变化揭示了其潜在的分相特性。实验也表明，盐效应（如NaCl的添加）提高了VLP在界面的聚集行为。

研究结论与意义

• 本研究开发的两种基于ATPS的B19病毒样颗粒回收工艺，分别从粗细胞裂解液和澄清裂解液中实现了高效分离。首次展示了通过调整PEG与盐浓度及相对体积比实现VLP高效集中与去杂的可能性。
• 第一种方法在底相实现了高达92.8%的VP1回收率，而第二种方法则通过界面分离实现了对于未组装VP2蛋白高效去除。
• 两套回收工艺均具有较高的实用性，在VLP疫苗开发、基因治疗等领域具有现实意义。

全文亮点

• 创新之处：利用改良水两相体系设计并优化了针对B19 VLP的两种回收流程，同时量化了VP1和VP2的特定分布特性。
• 工程应用潜力：研究为工业化生产提供了优化建议，通过规模化后续测试，有望大幅降低疫苗制造成本。
• 技术贡献：为病毒颗粒回收策略提供了重要理论支持，特别是在减少传统方法产物损失方面。

研究展望

未来工作需进一步探索该方法的工业扩展性，例如更大规模分离装置的开发及不同基质液的适用性。此外，应探讨如何整合ATPS与其他下游处理技术（如层析法）以实现更高纯度和更低成本的全面分离流程。

致谢

研究得到了MedImmune Inc.的材料支持，研究团队特别致谢Patricia Alred博士与Cynthia Oliver博士的技术指导，同时感谢Frank Luechau博士对于实验运行与设计的领导作用。

引文参考
研究引用了多处重要文献，为文中提及的背景理论、技术操作及结果分析提供了充分依据，包括Kajigaya et al.（1991）关于B19 VLP结构的研究，以及关于ATPS特性与优化的理论研究（如Kepka et al., 2005）。