本研究《血浆中miR-451a的下调可能促进凝血酶原表达并导致妊娠期糖尿病的高凝状态》是一篇发表在《Tropical Journal of Pharmaceutical Research》2020年10月第19卷第10期的原创性研究论文。以下是根据该论文内容撰写的学术报告。
妊娠期糖尿病高凝状态新机制与生物标志物的探索：一项关于miR-451a与凝血酶原F2的原创研究
一、 研究团队与发表信息
本研究的通讯作者是来自复旦大学附属妇产科医院的张浩（Hao Zhang），第一作者是苏州大学附属第三医院的邱敏（Min Qiu）。合作者包括苏州大学附属第三医院的商志敏（Zhimin Shangguan）。该研究团队由来自中国苏州和上海两地医院的妇产科及输血科研究人员组成。他们的研究成果于2020年10月正式发表于国际药学期刊《Tropical Journal of Pharmaceutical Research》（TJPR，2020; 19(10): 2079-2084）。该期刊是一本开放获取期刊，被科学引文索引（SCISearch）、Scopus等多个国际知名数据库收录。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于妇产科学、内分泌学与分子生物学的交叉领域，重点关注妊娠期糖尿病（Gestational Diabetes Mellitus， GDM）并发症的病理生理机制。GDM是妊娠期常见的并发症，可导致胚胎缺陷、流产、胎儿发育异常和早产等不良妊娠结局。在妊娠晚期，孕妇血液常呈现高凝状态，这种状态容易诱发静脉血栓形成，严重时可导致反复流产、早产甚至孕产妇死亡。临床发现，GDM患者常伴随血液高凝状态，但其背后的分子机制尚不完全清楚，也缺乏有效的诊断生物标志物。
凝血酶原（Prothrombin，由F2基因编码）是肝脏合成的维生素K依赖性凝血因子，其在凝血级联反应中被激活为凝血酶。其活化片段F1+2（F1+2）是凝血酶原活化的特异性分子标志物，与高血糖状态密切相关。近年来，微小RNA（microRNA, miRNA）因其在基因转录后调控中的关键作用而受到广泛关注，其长度约为18-22个碱基对，通过与靶基因信使RNA（mRNA）的3‘非翻译区（3’-UTR）结合来抑制其翻译或促进其降解。已有研究表明，GDM患者体内多种miRNA的表达水平发生改变，并可能参与凝血功能的调控。其中，miR-451a在GDM患者的胎盘外泌体中表达下调，但其在循环血液（血浆）中的水平及其与GDM高凝状态的具体关系尚不明确。
基于此，本研究设定了三个明确的研究目的：1) 检测并比较GDM患者与健康孕妇血浆中的F1+2水平和miR-451a表达水平；2) 评估miR-451a在GDM中的潜在作用；3) 探索miR-451a可能的下游靶基因及其调控凝血功能的分子机制。
三、 详细研究流程
本研究采用了从临床样本分析到体外细胞分子机制验证的系统性研究策略，主要包含以下六个紧密衔接的步骤。
步骤一：临床样本收集与凝血功能及标志物检测。 研究首先获得了苏州大学附属第三医院伦理委员会的批准。研究共纳入44名GDM患者和32名健康孕妇作为对照。使用TEG® 5000血栓弹力图仪（Haemonetics, USA）对所有受试者进行血栓弹力图（Thromboelastography， TEG）检测。采血采用双注射器法，血液经柠檬酸盐抗凝后，加入氯化钙溶液复钙，并置于预热的测量杯中开始检测。研究人员记录并分析了TEG的核心参数：凝血反应时间（R time）、凝血形成时间（K time）、凝固角（α angle）和最大振幅（MA）。这些参数分别反映凝血启动速度、凝血块形成速率、纤维蛋白形成速率以及血凝块的最终强度和稳定性。随后，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测两组受试者血浆中凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI，一种内源性纤溶受损的标志物）和凝血酶原片段1+2（F1+2）的水平。
步骤二：血浆miR-451a表达水平检测。 从上述临床血浆样本中提取总RNA。使用miRNA第一链cDNA合成试剂盒（Vazyme）将RNA逆转录为互补DNA（cDNA）。然后，采用miRNA SYBR qPCR Master Mix试剂盒（Vazyme）进行实时定量聚合酶链式反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction， qPCR），以检测miR-451a的相对表达量。使用U6小核RNA（U6 snRNA）作为内参基因进行数据标准化。所用引物序列已在论文方法部分详细列出。
步骤三：建立体外高糖细胞模型并验证初步关联。 为了在受控环境下模拟GDM的高血糖环境并探究机制，研究采用了人肝癌细胞系HepG2（来自美国模式培养物集存库ATCC）。将HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的培养基中，实验组用50 mM D-葡萄糖刺激72小时以建立高糖模型，对照组使用正常葡萄糖浓度。之后，通过qPCR检测高糖刺激后细胞内miR-451a的表达变化。同时，分别使用qPCR和蛋白质印迹（Western Blot）技术检测高糖处理后HepG2细胞中F2的mRNA和蛋白质表达水平，以验证高糖对F2的影响。
步骤四：探究miR-451a对F2表达的调控作用。 为了直接验证miR-451a与F2之间的功能关系，研究使用了合成的小RNA分子进行细胞转染实验。从吉凯基因（Genepharma）公司购买了合成的miR-451a模拟物（mimics，用于过表达miR-451a）、miR-451a抑制剂（inhibitor，用于敲低miR-451a）以及各自的阴性对照（NC mimic和NC inhibitor）。使用脂质体转染试剂Lipofectamine 3000（Thermo Fisher）将上述分子分别转染入HepG2细胞。首先，通过qPCR验证miR-451a mimics的过表达效率。随后，将成功过表达miR-451a的细胞分别置于正常葡萄糖和高葡萄糖培养基中培养，再次通过qPCR和Western Blot检测各组细胞中F2的表达变化，观察miR-451a过表达是否能逆转高糖诱导的F2升高。
步骤五：验证miR-451a与F2的直接靶向关系。 为了证明miR-451a是否直接作用于F2基因，研究采用了生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验相结合的方法。首先，通过TargetScan在线数据库预测发现，F2 mRNA的3‘-UTR区域存在与miR-451a种子序列互补结合的潜在位点。研究人员利用特异性引物扩增出F2基因的3’-UTR野生型序列，并将其克隆至pGL3报告质粒中萤火虫荧光素酶基因的下游，构建报告质粒pGL3-F2-wt。同时，通过定点突变试剂盒（Agilent Technologies）将预测的结合位点序列“acgguu”突变为“gccaaa”，构建突变型报告质粒pGL3-F2-mut。随后，在HepG2细胞中共转染：1）NC mimic + pGL3-F2-wt；2）miR-451a mimic + pGL3-F2-wt；3）NC mimic + pGL3-F2-mut；4）miR-451a mimic + pGL3-F2-mut。转染48小时后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega）裂解细胞并检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。萤火虫荧光素酶活性反映报告基因（即F2的3‘-UTR）的活性，海肾荧光素酶活性作为内参用于标准化。如果miR-451a直接结合F2的3’-UTR并抑制其翻译，那么在共转染miR-451a mimic和野生型报告质粒的组中，萤火虫荧光素酶活性应显著降低；而在突变型报告质粒组中，这种抑制作用应消失。
步骤六：数据统计与分析。 所有实验数据均以均值±标准差（mean ± SD）的形式表示。统计分析使用GraphPad Prism软件（版本5.04）完成。两组间的比较采用t检验。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。
四、 主要研究结果
结果一：GDM患者凝血功能增强且血浆miR-451a水平下调。 临床样本分析显示，与健康孕妇对照组相比，GDM患者的TEG参数发生了显著改变：凝血反应时间（R time）和凝血形成时间（K time）缩短，而凝固角（α angle）和最大振幅（MA）增大。这些变化共同表明，GDM患者的凝血启动更快、血凝块形成速率和强度更高，整体处于高凝状态。ELISA结果进一步支持了这一结论：GDM组血浆中纤溶抑制物TAFI水平降低，而凝血酶原活化标志物F1+2水平显著升高，提示凝血激活增强而纤溶能力相对减弱。与此同时，qPCR检测发现，GDM患者血浆中的miR-451a表达水平显著低于健康对照组。这一系列结果首次在临床层面将GDM患者的高凝状态与循环miR-451a的下调联系起来，为后续机制研究提供了有力的临床证据。
结果二：高糖处理肝细胞导致F2表达升高及miR-451a下调。 体外细胞实验结果与临床发现相呼应。在高糖处理的HepG2细胞中，miR-451a的表达水平显著降低。与此同时，高糖处理显著上调了F2基因的mRNA和蛋白质表达水平。这一结果直接证明了高葡萄糖环境可以模拟GDM的病理条件，导致肝细胞（凝血因子的主要合成场所）内miR-451a减少和F2（凝血酶原）增加，从而在细胞水平上建立了“高糖 → miR-451a↓ → F2↑”的初步因果链。
结果三：过表达miR-451a抑制F2的表达。 功能获得性实验证实了miR-451a对F2的负向调控作用。转染miR-451a mimics成功使细胞内miR-451a水平大幅升高。在正常葡萄糖条件下，过表达miR-451a即可降低F2的mRNA和蛋白水平。更重要的是，在高糖环境中，过表达miR-451a能够有效逆转高糖诱导的F2表达升高，使其恢复到接近正常水平。这强有力地表明，miR-451a的下调是高糖导致F2表达增加的关键环节。
结果四：miR-451a直接靶向F2 mRNA的3‘-UTR并抑制其表达。 双荧光素酶报告基因实验提供了分子机制的直接证据。生物信息学预测显示，miR-451a与F2 mRNA的3’-UTR存在特异性结合位点。实验结果表明，在共转染miR-451a mimic和野生型F2 3‘-UTR报告质粒的细胞中，荧光素酶活性显著降低（约下降50%）。然而，当报告质粒中的结合位点发生突变后，miR-451a mimic的抑制效应完全消失。这精确地证明了miR-451a通过其种子序列与F2 mRNA的3’-UTR特定区域直接结合，从而抑制其表达。反向实验（功能缺失性实验）进一步佐证了这一关系：转染miR-451a抑制剂敲低内源性miR-451a后，HepG2细胞中F2的mRNA和蛋白表达水平均显著升高。这些数据构成了一个完整的证据链，确立了miR-451a是F2的直接转录后负调控因子。
五、 结论与研究意义
本研究得出的核心结论是：在GDM患者中，血浆miR-451a的表达下调可能通过解除对凝血酶原（F2）的抑制，促进其表达，进而参与并加剧了血液的高凝状态。因此，循环miR-451a有望成为GDM患者高凝状态的一个潜在生物标志物。
本研究的科学价值主要体现在以下几个方面： 1. 机制创新：首次系统地揭示了miR-451a/F2轴在GDM高凝状态形成中的关键作用，从分子水平阐明了高血糖如何通过调控特定miRNA影响凝血因子表达，丰富了GDM并发症的病理生理学理论。 2. 转化潜力：发现血浆miR-451a作为无创、便捷的液体活检标志物，可能用于辅助评估GDM患者的血栓形成风险，为临床早期预警和干预提供了新思路。 3. 治疗靶点：研究提示，通过药物或基因手段上调miR-451a可能成为改善或纠正GDM患者高凝状态的一种潜在治疗策略，为未来药物开发提供了新的候选靶点。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
论文在讨论部分还对相关领域进行了延伸探讨。例如，提到GDM患者常伴有代谢异常（如妊娠中晚期高甘油三酯血症），这可能与高凝状态存在协同作用。此外，论文简要回顾了miR-451a在其他疾病（如甲状腺癌、胃癌、心血管应激）中的抑癌或保护作用，这从侧面印证了miR-451a在维持机体稳态中的广泛重要性。研究团队也明确声明了本研究无利益冲突，并遵循了开放获取的出版原则，有利于知识的快速传播。这项研究为理解和管理妊娠期糖尿病的高凝并发症提供了重要的新见解和科学依据。