基于遗传工程改造蛋白酶、ATP供应及itu操纵子以增强解淀粉芽孢杆菌产伊枯草菌素A及其抗真菌效果的研究报告
一、 研究作者、机构与发表信息 本项研究的主要作者为张岱元、黄阔、邹典、王斌、吴香兰、叶昌文* 和魏雪团*。其中，张岱元与黄阔为并列第一作者，叶昌文与魏雪团为通讯作者。研究机构涉及华中农业大学食品科学技术学院、农业微生物学国家重点实验室以及中国烟草总公司郑州烟草研究院。该研究论文发表于美国化学会旗下的 Journal of Agricultural and Food Chemistry 期刊，在线发表日期为2025年。论文的引用信息为：https://doi.org/10.1021/acs.jafc.5c05592。
二、 学术背景与研究目的 本研究属于微生物代谢工程与生物防治交叉领域，具体聚焦于利用合成生物学和基因工程手段，改造芽孢杆菌以高效生产具有强效抗真菌活性的天然脂肽化合物——伊枯草菌素A (Iturin A)。
研究背景：霉菌污染在农业生产、加工和储存过程中普遍存在，不仅造成巨大的经济损失，其产生的真菌毒素更严重威胁人类与动物健康。目前，物理防霉方法（如辐照、热处理）效率低、能耗高，而化学杀菌剂则存在食品安全和环境污染的隐患。因此，开发安全高效的替代策略迫在眉睫。伊枯草菌素A作为一种由芽孢杆菌产生的环状脂肽，具有广谱、高效的抗真菌活性，且不易诱导耐药性，被证明对动物高度安全，并显示出抗病毒、抗癌等多种生物活性，是一种极具潜力的环保型生物防治剂。然而，其工业化应用的主要瓶颈在于微生物发酵产量低。由于尚无化学合成方法报道，提高产量完全依赖于优化微生物的生物合成途径。
现有挑战与策略：目前，提高伊枯草菌素A产量的代谢工程努力主要集中于改造其生物合成基因簇（itu操纵子）和增加前体（如脂肪酸、氨基酸）供应。例如，通过替换强启动子、增强脂肪酸合成途径、提高丝氨酸前体浓度或过表达转运蛋白基因，均能在不同程度上提升产量，但距离工业化需求仍有差距。因此，开发新的增效策略至关重要。解淀粉芽孢杆菌（*Bacillus amyloliquefaciens*）是已知的高效伊枯草菌素A生产者。值得注意的是，芽孢杆菌通常会分泌多种非必需但可能降解目标产物的胞外蛋白酶。此外，三磷酸腺苷（ATP）作为细胞的“能量货币”，在包括次级代谢物合成在内的各种生物合成途径中扮演核心角色。然而，在伊枯草菌素A的生产中，系统性地敲除非必需蛋白酶基因以稳定产物、以及通过工程化手段增强ATP供应以提高合成效率，这两种策略此前尚未被深入探索。
研究目的：本研究旨在通过一种新颖的组合策略，显著提升解淀粉芽孢杆菌生产伊枯草菌素A的能力。具体目标包括：1）评估敲除一系列非必需蛋白酶基因对伊枯草菌素A产量和稳定性的影响，并确定最优的蛋白酶缺陷型宿主；2）在该宿主中，通过过表达与ATP生成相关的关键基因（ndk 和 *pyk*）来增强细胞内ATP供应，考察其对伊枯草菌素A合成的促进作用；3）在优化了蛋白酶缺陷和ATP供应的基础上，进一步对伊枯草菌素A的生物合成操纵子（itu operon）进行启动子工程改造，以最大化其转录和表达；4）最终，评估所构建的高产工程菌株及其产物的抗真菌效力，通过在体外平板、烟草叶片和苹果上的实验，验证其作为生物防治剂的潜力。
三、 详细研究流程与方法 本研究遵循了从宿主底盘优化、能量代谢强化、到生物合成途径增强，最后进行功能验证的系统性工程化流程。
1. 菌株、质粒与培养条件： * 起始菌株：使用 Bacillus amyloliquefaciens HZ-12 作为野生型出发菌株和遗传改造的基础。 * 工程菌株构建：研究涉及构建一系列基因敲除、基因过表达和启动子插入菌株。所用质粒包括用于整合的穿梭载体T2(2)-ori和用于过表达的pHY-300PLK。所有菌株和质粒信息详列于论文表1。 * 培养与发酵：细菌在LB培养基中培养，真菌在SDA培养基中培养。伊枯草菌素A的发酵在特定发酵培养基（含豆粕、葡萄糖等）中进行，于37°C、180 rpm下振荡培养72小时。
2. 实验流程与操作方法： 流程一：构建蛋白酶缺陷型菌株并评估其对伊枯草菌素A合成的影响。 * 研究对象与样本量：使用了实验室前期保存的9个蛋白酶缺陷型菌株（BAX-2至BAX-10），它们是在HZ-12基础上依次敲除了不同组合的蛋白酶基因（如 epr, nprE, aprE, vpr 等，详见图1a）。以野生型HZ-12作为对照。 * 处理方法与实验：将所有菌株在相同条件下进行发酵。发酵结束后，取发酵液，用甲醇提取粗脂肽，通过高效液相色谱（HPLC）定量分析伊枯草菌素A的产量。同时，使用离子淌度四极杆飞行时间质谱（IMS QTOF）对产物中的伊枯草菌素A同系物进行鉴定。 * 降解实验：为了验证蛋白酶对伊枯草菌素的降解作用，收集HZ-12和筛选出的最优蛋白酶缺陷菌株BAX-8的细胞，将其与等体积的含伊枯草菌素A的发酵上清液混合，在37°C水浴中孵育12小时，通过HPLC检测伊枯草菌素A含量的变化，以无菌发酵上清液作为对照。 * 数据分析：使用GraphPad Prism软件进行两组间的双尾非配对t检验，p值小于0.05认为具有统计学显著性。
流程二：在最优蛋白酶缺陷宿主中增强ATP供应。 * 研究对象：选择BAX-8作为进一步改造的宿主。 * 基因操作：选择了两个与ATP生成相关的关键基因进行过表达：*ndk*（编码核苷二磷酸激酶，优化ATP/核苷酸平衡）和 *pyk*（编码丙酮酸激酶，糖酵解途径中产生ATP的关键酶）。 * 操作方法：通过重叠延伸PCR（Overlap Extension PCR）将来自 Bacillus subtilis 168的强组成型启动子P43、目标基因（ndk 或 *pyk*）以及来自 Bacillus licheniformis DW2的终止子tAmyL进行融合，然后克隆到pHY-300PLK质粒中，构建过表达载体pHY-ndk和pHY-pyk。通过电转化将质粒导入BAX-8，获得工程菌BAX-8/pHY-ndk和BAX-8/pHY-pyk。含有空载体pHY-300的菌株BAX-8/pHY-300作为对照。 * 产量与ATP检测：对工程菌进行发酵并检测伊枯草菌素A产量。同时，使用ATP荧光检测试剂盒测定各菌株细胞内的ATP浓度。
流程三：组合遗传修饰以最大化伊枯草菌素A产量。 * 策略：为避免质粒过表达带来的代谢负担和抗生素使用对细胞活性的潜在抑制，本研究转向使用染色体整合的启动子工程策略。 * 操作方法： 1. 第一步（BAX-BAC1）：在BAX-8菌株中，将强启动子P43通过同源重组整合到染色体上 ndk 基因的上游，构建菌株BAX-BAC1。此步骤旨在稳定增强ATP供应。 2. 第二步（BAX-BAC2）：在BAX-BAC1的基础上，将另一个强启动子（P*bacA*）整合到伊枯草菌素A生物合成基因簇（itu操纵子）的第一个基因 ituD 的上游，构建菌株BAX-BAC2。此步骤旨在增强整个操纵子的转录。 3. 第三步（BAX-BAC3）：在BAX-BAC2的基础上，进一步将P*bacA*启动子整合到操纵子内的另一个关键基因 ituA 的上游，构建最终的高产工程菌株BAX-BAC3。此步骤旨在对合成途径进行更精细的强化。 * 验证：通过实时定量PCR（qRT-PCR）分析 ndk, ituD, ituA 基因在启动子插入后的转录水平变化。同时，监测工程菌株的生物量（生长曲线），以确保产量提升不是以牺牲细胞生长为代价。
流程四：评估工程菌株的抗真菌效果。 * 指示真菌：选择了两种常见的、具有代表性的采后病原真菌：产黄青霉（*Penicillium chrysogenum*）和扩展青霉（*Penicillium expansum*）。 * 体外平板抑菌实验：采用牛津杯法。将真菌孢子悬液与SDA培养基混合倒板，放置牛津杯后，分别加入不同菌株的细菌悬液或粗脂肽提取物。培养7天后，测量抑菌圈直径。 * 烟草叶片生物防治实验： * 样本：健康烟草叶片。 * 处理：叶片表面消毒后，喷洒 P. chrysogenum 孢子悬液，然后分别喷洒不同浓度（10^5, 10^6, 10^7 CFU/ml）的HZ-12或BAX-BAC3细菌悬液，或以无菌水作为对照。另设一组实验，喷洒等量的粗脂肽提取物（以甲醇提取的灭菌发酵培养基作为对照）。 * 评估：叶片于28°C培养7天后，观察霉菌生长情况，并进行真菌菌落计数。 * 苹果生物防治实验： * 样本：表面消毒后的苹果。 * 处理：在苹果上打孔，加入 P. expansum 孢子悬液，然后分别加入不同浓度的HZ-12或BAX-BAC3细菌悬液，或以无菌水作为对照。另设一组实验，加入等量的粗脂肽提取物。 * 评估：苹果于28°C培养4天后，观察感染情况，并测量病斑直径。
四、 主要研究结果 1. 蛋白酶缺陷对伊枯草菌素A合成的影响： * 产量变化：随着敲除的蛋白酶基因数量增加，伊枯草菌素A产量呈现先略降后显著升高的趋势。当敲除8个蛋白酶基因（菌株BAX-8）时，产量达到最高值0.51 g/L，比野生型HZ-12（0.285 g/L）提高了79%（图1b）。质谱分析证实产物主要为C14-和C15-伊枯草菌素A同系物。 * 降解验证：降解实验表明，野生型HZ-12的细胞能在12小时内降解约30%的伊枯草菌素A，而蛋白酶缺陷菌株BAX-8的细胞组中，伊枯草菌素A水平比HZ-12组高29%（图1c）。这直接证明了敲除蛋白酶能有效减少伊枯草菌素A或其合成相关蛋白的降解，是产量提升的重要原因。 * 宿主选择：研究指出，基因缺失对细胞代谢的影响是复杂的多基因互作结果。单独敲除 htrB 基因对产量无显著影响，说明BAX-8的高产是多个蛋白酶基因缺失协同作用的结果。BAX-8被选定为后续研究的高产宿主。
2. 增强ATP供应对伊枯草菌素A合成的影响： * 产量提升：在BAX-8宿主中过表达 ndk 和 pyk 基因。与对照（BAX-8/pHY-300）相比，过表达 ndk 的菌株（BAX-8/pHY-ndk）伊枯草菌素A产量提高了66%，而过表达 pyk 的菌株提高了14%（图2b）。 * ATP水平：BAX-8/pHY-ndk菌株的细胞内ATP浓度达到5.81 μmol/g DCW，是对照组的1.44倍（图2c）。这证实了过表达 ndk 能显著增强细胞的ATP供应，从而有力地促进了伊枯草菌素A的生物合成。这一结果将ATP供应管理与伊枯草菌素A的合成成功关联起来。
3. 组合遗传修饰的叠加效应： * 逐步增产：为了避免质粒系统的缺点，研究转向染色体整合。首先，在BAX-8中整合P43启动子至 ndk 基因上游，构建BAX-BAC1，其产量达到0.74 g/L，比HZ-12提高1.44倍（图3）。 * 操纵子强化：随后，在BAX-BAC1中整合P*bacA*启动子至 ituD 基因上游，构建BAX-BAC2，产量比HZ-12提高2.52倍。 * 最终高产菌株：进一步在BAX-BAC2中整合P*bacA*启动子至 ituA 基因上游，得到最终工程菌BAX-BAC3。其伊枯草菌素A产量达到1.20 g/L，是野生型HZ-12的2.99倍（图3）。 * 机理验证：qRT-PCR结果显示，BAX-BAC3中 ndk, ituD, ituA 基因的转录水平均显著上调（图S4）。同时，BAX-BAC3的生长曲线与HZ-12无显著差异（图S3），表明产量提升并非源于生物量的增加，而是代谢通量重新定向的结果。
4. 抗真菌效果评估： * 体外抑菌：无论是细菌悬液还是粗脂肽提取物，BAX-BAC3对两种青霉菌（P. chrysogenum 和 *P. expansum*）的抑菌圈直径均显著大于HZ-12，增幅在44%至53%之间（图4）。这直接证明了增加的伊枯草菌素A产量转化为了更强的体外抗真菌活性。 * 烟草叶片保护实验：随着细菌悬液浓度的增加，两种菌株对烟草叶片霉变的保护作用均增强。但在相同浓度下，BAX-BAC3的效果远优于HZ-12。例如，在10^6 CFU/ml浓度下，BAX-BAC3处理使霉菌数量减少87%，而HZ-12仅减少55%（图5a-d）。使用粗脂肽提取物时，BAX-BAC3提取物的保护效果（减少92%霉菌）也显著强于HZ-12提取物（减少59%）（图5e-f）。 * 苹果保护实验：在苹果蓝霉病模型上观察到类似趋势。BAX-BAC3细菌悬液在10^7 CFU/ml时可使病斑直径减少60%，而HZ-12仅减少33%（图6a-d）。BAX-BAC3的粗脂肽提取物使病斑直径减少47%，也优于HZ-12提取物的26%（图6e-f）。
五、 研究结论与价值 本研究成功开发并验证了一种通过多策略组合遗传工程显著提高解淀粉芽孢杆菌生产伊枯草菌素A能力的新方法。结论如下： 1. 构建了高效工程菌株：通过系统性地敲除非必需蛋白酶基因、增强ATP供应（过表达 *ndk*）以及对itu操纵子进行启动子工程改造，成功构建了高产伊枯草菌素A的工程菌株 Bacillus amyloliquefaciens BAX-BAC3，其产量达到1.20 g/L，是野生型的2.99倍。 2. 阐明了关键作用机制：研究首次揭示了蛋白酶缺陷型宿主能通过减少伊枯草菌素A或其合成酶的降解来提高产量；同时证明了增强细胞内ATP供应是提升伊枯草菌素A合成的有效策略。 3. 证实了生物防治潜力：体内外抗真菌实验充分证明，提高的伊枯草菌素A产量直接转化为更强的抗真菌活性。工程菌株BAX-BAC3及其产物能有效防治由产黄青霉和扩展青霉引起的烟草叶片和苹果的霉菌感染，展示了其作为高效、安全生物防治剂的巨大应用前景。
科学价值：本研究为微生物次级代谢产物（尤其是非核糖体肽）的产量提升提供了新的工程化思路和明确的技术路线。它将通常用于蛋白质表达的蛋白酶缺陷宿主策略，以及能量代谢工程策略，创造性地应用于脂肽类小分子的生产，拓展了代谢工程工具箱。研究中对itu操纵子进行多基因位点的启动子强化，也为复杂次级代谢途径的精细调控提供了范例。
应用价值：该研究直接针对伊枯草菌素A产量低的产业瓶颈，通过遗传改造获得了具有工业化应用潜力的高产菌株。所生产的伊枯草菌素A在农产品采后保鲜、烟草防霉等领域具有直接的应用价值，为减少化学杀菌剂使用、保障食品安全和减少环境污染提供了有前景的生物学解决方案。
六、 研究亮点 1. 策略新颖性：首次将“构建蛋白酶缺陷型宿主”与“增强ATP供应”两种策略相结合并应用于提高伊枯草菌素A的产量，这是该研究最核心的创新点。 2. 系统性工程路径：研究遵循了从底盘细胞优化（蛋白酶敲除）→ 能量供应强化（ATP工程）→ 生物合成途径增强（操纵子改造）的递进式、系统化代谢工程逻辑，每一步都有明确的数据支撑和机理阐释，逻辑严谨。 3. 显著的产量提升：最终菌株BAX-BAC3实现了近3倍的产量提升，达到1.20 g/L，为后续的工业化开发奠定了坚实的产量基础。 4. 完整的功能验证：研究不仅停留在产量数据，还通过体外抑菌、离体叶片和完整果实等多种模型，全面、有力地验证了高产菌株及其产物的实际生物防治效果，使研究成果更具说服力和应用导向性。 5. 机理深入探究：不仅展示了