基于整合多组学与体内分析的临床前研究：揭示鞣花单宁Geraniin缓解溃疡性结肠炎的潜在机制
一、 研究团队与发表信息
本研究由来自中国安徽省安庆市立医院消化内科的Chang Cheng、Wei Wang、Tingting Zheng、Chong Fu，以及安庆师范大学生命科学学院的Xiangmin Shi共同完成。其中，Chang Cheng和Wei Wang为共同第一作者，Tingting Zheng、Xiangmin Shi和Chong Fu为共同通讯作者。该研究成果以题为《A preclinical investigation into the potential associations of Geraniin with ulcerative colitis alleviation through integrated multi-omics and in vivo analysis》的原创研究论文形式，于2026年5月13日发表在学术期刊《Frontiers in Medicine》上，文章识别码为10.3389/fmed.2026.1821762。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于胃肠病学与免疫药理学交叉领域，聚焦于炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）中的溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）的治疗新策略探索。UC是一种慢性、非特异性、复发性肠道炎症性疾病，严重影响患者生活质量，且重症有癌变风险。当前临床常用药物如糖皮质激素和免疫抑制剂存在复发率高、副作用多等局限，因此寻找更优治疗选择至关重要。
Geraniin（鞣花单宁， 即老鹳草素）是一种天然多酚化合物，广泛存在于老鹳草、龙眼、叶下珠等植物中。前期研究表明，Geraniin具有良好的抗氧化、抗炎特性，例如能够抑制NF-κB和MAPK等炎症信号通路，减少TNF-α、IL-6等促炎因子释放，并在关节炎等炎症模型中显示出治疗潜力。此外，其生产成本较低、多靶点协同效应和低毒性的优点，使其在治疗炎症相关疾病方面具有临床前潜力。然而，关于Geraniin在肠道炎症，特别是UC中的具体抗炎机制，现有文献十分有限。
因此，本研究旨在通过整合网络药理学、转录组学、单细胞测序技术和体内动物实验，系统地探究Geraniin缓解DSS（葡聚糖硫酸钠）诱导的小鼠溃疡性结肠炎的潜在分子机制和效果，为未来将其开发为UC治疗药物的转化研究提供临床前依据。核心科学问题是：Geraniin是否以及如何通过调节免疫细胞（特别是巨噬细胞和中性粒细胞）的功能状态来缓解UC。
三、 详细研究流程与方法
本研究采用了从生物信息学预测到体内实验验证的完整闭环研究策略，主要包含以下五个核心步骤：
第一步：生物信息学分析与潜在靶点预测 1. 数据来源：研究从GEO数据库获取了人类UC的转录组数据集GSE47908（包含45例UC患者和15例健康对照）和单细胞RNA测序数据集GSE214695（包含6例UC患者和6例健康对照）。同时，从比较毒物基因组学数据库、SwissTargetPrediction和BindingDB数据库中筛选预测Geraniin的潜在作用靶点。 2. 差异基因与共表达网络分析：对GSE47908数据集，使用R语言“limma”包进行差异表达基因分析，筛选出UC与正常组织间的差异基因。同时，利用加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）R包，构建基因共表达网络，识别与UC表型最相关的基因模块（本研究确定为lightcyan和棕色模块）。将差异基因与关键模块基因取交集，最终得到337个UC疾病相关基因。 3. 通路富集分析：使用“clusterProfiler”R包对337个疾病相关基因进行基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析，以了解这些基因参与的生物学过程和信号通路。 4. 药物-疾病靶点整合与网络构建：将预测得到的27个Geraniin靶点基因与337个UC疾病相关基因取交集，得到3个共同靶点（PPARG, NOS2, IL1B）。随后，将所有疾病相关基因与药物靶点导入STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，并利用Cytoscape软件的MCODE插件挖掘关键子网络，得到一个包含42个核心基因的枢纽网络。 5. 免疫浸润与单细胞分析：使用CIBERSORT算法估算GSE47908数据集中样本的免疫细胞浸润比例，分析UC与健康对照间的免疫微环境差异，并关联核心基因与特定免疫细胞的相关性。对单细胞数据集GSE214695，使用“Seurat”包进行质控、标准化、降维（PCA和UMAP）、聚类和细胞类型注释（得到10种主要细胞类型）。最后，利用AUCell算法计算Geraniin靶点基因集在不同细胞亚群中的富集得分，以确定其作用的潜在细胞类型。
第二步：动物模型建立与处理 1. 实验动物与伦理：研究使用20只8周龄雄性C57BL/6小鼠，饲养于SPF级环境。所有动物实验均经安庆师范大学动物护理与实验委员会批准。 2. 分组与建模：小鼠随机分为4组（每组5只）：对照组、模型组（DSS）、模型+Geraniin低剂量组（30 mg/kg）、模型+Geraniin高剂量组（60 mg/kg）。除对照组外，其余组饮用含2.5% DSS的水连续7天以诱导急性结肠炎。同时，各治疗组每天灌胃给予相应剂量的Geraniin，对照组和模型组给予溶剂。 3. 表型评估：每日记录小鼠体重、粪便性状和便血情况，计算疾病活动指数（Disease Activity Index, DAI）。实验结束时处死小鼠，测量结肠长度，并收集结肠组织用于后续分析。评估过程采用盲法以减少偏倚。
第三步：组织病理学与分子生物学检测 1. 组织病理学评估：取远端结肠组织进行石蜡包埋、切片、H&E染色。在光镜下根据既定标准对隐窝结构破坏、黏膜病变深度和范围、炎症细胞浸润程度进行评分，计算总组织病理学损伤评分。 2. 蛋白质印迹分析：提取结肠组织总蛋白，通过Western Blot检测PPARγ和iNOS（NOS2蛋白）的表达水平，以GAPDH作为内参。 3. 免疫荧光染色：对结肠组织切片进行多重免疫荧光染色，检测以下指标： * 中性粒细胞胞外陷阱：通过髓过氧化物酶（Myeloperoxidase, MPO）和瓜氨酸化组蛋白H3（Citrullinated Histone H3, CitH3）共定位来标记NETs形成。 * 中性粒细胞浸润：通过Ly-6G标记中性粒细胞。 * 巨噬细胞极化：通过F4/80（泛巨噬细胞标记）分别与CD86（M1型标记）和CD206（M2型标记）共定位，来区分促炎M1型和抗炎M2型巨噬细胞。 使用激光共聚焦显微镜成像，并通过ImageJ软件定量平均荧光强度或阳性细胞百分比。
第四步：数据分析 所有体外和体内实验数据均使用GraphPad Prism软件进行统计分析。多组间比较，符合正态分布的数据采用单因素方差分析（ANOVA）后接Tukey事后检验，非正态分布数据采用Kruskal-Wallis检验。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。
四、 主要研究结果
结果1：生物信息学预测揭示Geraniin可能通过调节巨噬细胞和中性粒细胞相关通路起作用。 * WGCNA分析成功鉴定出与UC最相关的lightcyan和棕色基因模块。GO和KEGG富集分析显示，337个UC相关基因显著富集于对细菌分子和脂多糖的反应、IL-17信号通路、TNF信号通路、CXCR趋化因子受体结合等炎症相关通路。 * 构建的PPI网络及MCODE分析得到的42个枢纽基因，在UC患者组织中表达显著异常。免疫浸润分析表明，这些枢纽基因的表达与M1型巨噬细胞、中性粒细胞和活化CD4 T细胞的浸润水平显著相关。 * 关键发现：单细胞测序数据的AUCell分析显示，Geraniin的27个预测靶点基因特征在巨噬细胞和中性粒细胞簇中富集得分最高。这提示Geraniin的作用可能特异性地针对这两种在UC发病中至关重要的免疫细胞，而非广泛作用于所有结肠细胞类型，体现了其潜在的选择性。
结果2：体内实验证实Geraniin能显著缓解DSS诱导的小鼠结肠炎临床症状和组织损伤。 * 疾病活动度：与模型组相比，Geraniin治疗组（尤其是60 mg/kg组）小鼠的DAI评分从建模中期开始显著降低。 * 宏观指标：模型组小鼠结肠长度因炎症而显著缩短，而Geraniin治疗有效逆转了这种缩短，结肠长度接近对照组。 * 组织病理学：模型组结肠组织表现出严重的黏膜水肿、炎症细胞大量浸润和隐窝结构破坏。Geraniin治疗显著改善了这些病理变化，组织损伤评分明显下降。 * 结论关联：这些表型结果直接证明了Geraniin在体内具有缓解UC的潜力，为后续机制探究提供了表型基础。
结果3：Geraniin调控巨噬细胞极化相关蛋白表达。 * Western Blot结果显示，DSS模型组结肠组织中M2型巨噬细胞的关键调控因子PPARγ蛋白表达下调，而M1型巨噬细胞的特征酶iNOS（NOS2）表达上调。 * Geraniin治疗剂量依赖性地逆转了这种异常：上调了PPARγ的表达，同时下调了iNOS的表达。 * 逻辑衔接：此分子水平证据与生物信息学预测的靶点（PPARG, NOS2）相吻合，并将表型改善与巨噬细胞极化状态的潜在调控联系起来。
结果4：免疫荧光证实Geraniin减少中性粒细胞浸润与NETs形成，并调节巨噬细胞表型。 * 中性粒细胞与NETs：模型组结肠组织中Ly-6G阳性的中性粒细胞浸润显著增加，同时MPO和CitH3双阳性的NETs结构也大量存在。Geraniin治疗显著降低了中性粒细胞的数量和NETs的形成标志。 * 巨噬细胞极化：免疫荧光双标显示，模型组结肠中F4/80+/CD86+的M1型巨噬细胞比例升高，而F4/80+/CD206+的M2型巨噬细胞比例降低，M1/M2比值升高。Geraniin治疗有效逆转了这一趋势：减少了M1型巨噬细胞，增加了M2型巨噬细胞，使M1/M2比值趋向正常。 * 结果整合与贡献：这部分结果从细胞水平直接验证了生物信息学的预测。Geraniin不仅减少了促炎中性粒细胞的招募及其有害的NETs释放，还促进了巨噬细胞从促炎的M1型向抗炎/修复的M2型转化。这两方面效应共同指向Geraniin通过调节“巨噬细胞-中性粒细胞轴”来改善肠道免疫微环境，这可能是其缓解结肠炎的核心细胞机制。体内表型改善（结果2）和分子蛋白变化（结果3）在此得到了细胞层面的解释。
五、 研究结论与价值
本研究得出结论：天然化合物Geraniin在DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型中显示出显著的缓解作用。其潜在作用机制与多靶点、多通路调节有关，核心在于调节肠道免疫微环境中的关键免疫细胞。具体而言，Geraniin可能通过上调PPARγ和下调iNOS的表达，促进巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型转化；同时，它能抑制中性粒细胞向炎症部位的募集及其过度形成中性粒细胞胞外陷阱。这些免疫调节作用的协同效应，共同导致了结肠炎症的减轻和组织损伤的修复。
科学价值： 1. 机制创新性：本研究首次在UC背景下，通过整合多组学与体内实验，系统揭示了Geraniin特异性作用于巨噬细胞和中性粒细胞，并调节二者功能状态的潜在机制。特别是明确了其对巨噬细胞极化（M1向M2转换）和NETosis的抑制作用，为理解多酚类化合物抗结肠炎的作用提供了新的视角。 2. 研究策略示范：研究采用了“计算预测（网络药理学+单细胞组学）-> 体内表型验证 -> 分子与细胞机制深入探究”的完整研究范式，为天然产物药理学研究提供了可借鉴的方法学框架。 3. 靶向性启示：AUCell分析提示Geraniin的作用具有细胞类型选择性，这不同于许多广谱抗炎多酚，暗示其可能具有更精确的作用模式和更低的脱靶风险，为开发靶向肠道特定免疫细胞的疗法提供了新思路。
应用价值： 本研究为将Geraniin开发成为治疗溃疡性结肠炎的潜在新型药物提供了坚实的临床前证据。其天然来源、多靶点、低毒性的特点，符合当前对更安全、有效UC治疗药物的需求。研究指明的PPARγ/iNOS轴以及巨噬细胞-中性粒细胞轴，可作为后续药物优化和联合用药的靶点参考。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
研究也对局限性进行了坦诚讨论：作为一项早期临床前研究，其结果尚需在人类UC队列中直接验证，且目前的结果主要显示相关性，未来需要利用基因敲除或特异性拮抗剂等工具进一步验证因果机制。此外，虽然观察到了NETs形成的减少，但对其中具体的信号通路（如PAD4或ROS依赖途径）的深入剖析将是未来研究的重点。这些讨论体现了研究的严谨性和前瞻性。
这项研究通过一套完整且先进的技术体系，有力地论证了天然化合物Geraniin通过调节巨噬细胞极化和抑制中性粒细胞有害反应来缓解溃疡性结肠炎的潜力，为后续的转化医学研究和药物开发奠定了重要的理论基础。