心肌缺血再灌注损伤大鼠梗死核心及周边区域的空间转录组异质性：靶向Piezo1信号的研究 ——学术报告
一、研究概况
该原创性研究由华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉与疼痛医学科的Zhen Li、Fan Jiang、Hongbing Xiang等，以及海南医科大学附属海南医院麻醉科的Yan Chen、Duozhi Wu等研究人员共同完成。研究论文于2026年发表于《MedComm》期刊。本项研究利用空间转录组学（Spatial Transcriptomics, ST）结合单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术，绘制了大鼠心肌缺血再灌注（Myocardial Ischemia-Reperfusion, MIR）损伤后左心室基因表达的详细图谱，并识别了机械敏感离子通道Piezo1在其中的关键作用。
二、学术背景
心肌缺血再灌注损伤是导致心功能障碍的主要原因之一，尽管及时恢复血流灌注能够缩小心肌梗死面积并降低急性死亡率，但再灌注过程本身也会引发细胞坏死、内皮功能障碍、钙处理异常、氧化应激及炎症等一系列不良后果。目前，针对这些病理生理变化的药物治疗缺乏组织特异性，且对MIR损伤后基因表达的空间异质性（Spatial Heterogeneity）理解有限。单细胞测序虽能深入解析细胞层面的转录状态，但丢失了空间位置信息。空间转录组学则弥补了这一不足，能够原位置保留基因表达的数据。然而，由于既往研究无法精确区分梗死区（Infarct Zones）与不完全梗死区（Incomplete Infarct Areas），对这两个关键病理区域分子事件的时空序列理解仍不充分。此外，机械敏感离子通道Piezo1在心肌细胞中表达，感知细胞膜张力，与钙离子内流及活性氧产生相关，但其在受损心肌中的空间分布和动态表达尚未明确。因此，本研究旨在应用空间转录组学精确解析MIR损伤后不同区域的转录组异质性，并结合单细胞数据，明确Piezo1的表达变化及其作为潜在治疗靶点的价值。
三、详细研究流程
本研究的整体工作流程可分解为以下几个核心环节： 1. 动物模型建立与样本制备： 研究选用9周龄雄性Sprague-Dawley大鼠，通过结扎左前降支冠状动脉30分钟后再灌注2小时，建立MIR损伤模型。实验中使用心电图监测并确认心肌缺血状态。随后，从三只MIR模型大鼠心脏的结扎部位以下位置采集左心室短轴切片，切片包含整个心室横截面，涵盖了梗死区及周围区域。 2. 空间转录组学测序与初步分析： 将制备的心室组织切片装载到10× Genomics Visium空间转录组学阵列上，进行H&E染色、成像和组织透化优化，以使释放的mRNA与阵列上的捕获探针结合。通过合成荧光标记的cDNA来检测最佳透化时间。文库构建完成后，使用Illumina NovaSeq 6000系统进行测序，每个条形码区域至少达到50,000个读对。原始数据采用Space Ranger软件（2.0.1版）与mRatBN7.2参考基因组比对，生成基因表达矩阵。 3. 区域注释与聚类分析： 由病理学家在H&E染色图像上精细划分形态学区域，注释出梗死区、不完全梗死区和边界区（Border Zones）等。研究者进一步使用Seurat R包进行数据标准化、高变基因筛选和主成分分析，并通过非监督的Louvain聚类将11,957个捕获点划分为8个基因表达簇（Cluster）。 4. 整合单细胞RNA测序与细胞类型反卷积： 为解析空间转录组学数据背后的细胞基础，研究获取了假手术组和MIR组大鼠的左心室组织，制备单细胞悬液并进行单细胞RNA测序（scRNA-seq，同样基于10× Genomics Chromium平台）。在Seurat中完成质控、标准化、降维和聚类注释后，所有主要的细胞类型被保留。随后，采用稳健细胞类型分解（Robust Cell Type Decomposition, RCTD）算法，将scRNA-seq数据映射到空间转录组学数据上，以推断每个捕获点内的细胞类型组成。在后续聚焦Piezo1的分析中，特异性提取了心肌细胞进行再聚类，并以此为参考进行空间反卷积。 5. 功能分析与伪时间轨迹推断： 对不同簇的标记基因进行GO和KEGG通路富集分析，以解析其生物学功能。为了解心肌细胞在损伤后的状态转变，使用Monocle2进行伪时间轨迹分析，推断细胞分化轨迹并识别随伪时间变化的基因表达模块。 6. 靶标分子验证与功能实验： 研究选取了空间和单细胞分析中均显著变化的Piezo1、RyR2、MMP2和SERCA2作为靶点。通过Western blot和免疫荧光共染色（与心肌细胞标记物Actn2共染）在蛋白水平验证这些分子在梗死区、边界区、远端区及假手术组中的表达变化。并在体外使用H9c2心肌细胞系建立缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation, H/R）模型，在H/R处理期间分别使用Piezo1抑制剂（GsMTx4）和激动剂（Yoda1），通过Fluo-4 AM探针检测细胞内钙离子（Ca²⁺）浓度变化，以验证Piezo1对钙超载的功能影响。
四、主要研究结果
1. 空间转录组异质性与区域特征： 通过对H&E染色图像的病理学标注和Louvain聚类分析，研究揭示了五个主要的基因表达簇，这些簇的空间分布与形态学区域高度契合。其中，簇1、2、3主要代表非梗死区心肌细胞的基因，富集了线粒体核糖体蛋白基因和TGF-β通路基因，与抗炎和促血管生成作用相关。簇4、5、7则分别对应梗死区、不完全梗死区和边界区。特别地，梗死区（簇4）的标记基因主要富集在铁死亡（Ferroptosis）和黏着斑通路，而不完全梗死区（簇5）则高度激活了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、白介素-17（IL-17）和破骨细胞分化（Osteoclast Differentiation）信号通路。RCTD细胞类型映射进一步显示：梗死区以单核/巨噬细胞和T细胞浸润为主；不完全梗死区表现出显著的中性粒细胞浸润和平滑肌细胞的增加；边界区则以平滑肌细胞和成纤维细胞占优势。
2. 功能与代谢途径的区带差异： GO分析显示，非梗死区基因功能集中于辅酶Q生物合成、线粒体翻译等稳态过程；梗死区富集了血红素生物合成和过氧化氢降解过程；不完全梗死区则富集于缺氧反应与凋亡调控。KEGG分析表明，远端非梗死区以氧化磷酸化通路为主，而梗死区与不完全梗死区共享了卟啉代谢特征。通过对比基因表达差异（Differentially Expressed Genes, DEGs），研究发现不完全梗死区较其邻近的边界区显著上调了MAPK、IL-17、破骨细胞分化及凋亡通路相关基因（如Fos, Jun）。相反，梗死区与不完全梗死区比较，其共享和特有的差异基因进一步揭示了在完全和不完全梗死进程中，MAPK、TNF及铁死亡通路的不同调控模式。
3. 铁死亡与自噬失调是梗死区的关键特征： 比较梗死区与非梗死区发现，梗死区上调基因显著富集于铁死亡和坏死性凋亡通路。空间特征图直观显示，铁死亡关键基因Alox15在梗死区特异性高表达。进一步分析发现，介导铁蛋白吞噬的Ncoa4在梗死区特异性上调，而不完全梗死区的血红素加氧酶-1（Hmox-1）表达升高，转铁蛋白受体Tfrc和去泛素化酶Usp7无显著变化，这表明铁蛋白吞噬是铁超载的主要原因。同时，梗死区表现出巨自噬相关基因（如Beclin1, Map1lc3b）的表达显著下降，而线粒体自噬相关基因（Bnip3l, Pink1）表达增加，伴随着泛素蛋白Ubb和E3泛素连接酶Mkrn1的上调，提示泛素依赖和非泛素依赖的蛋白降解途径介导的自噬缺陷和过度线粒体自噬可能加剧了MIR损伤。
4. Piezo1的时空动态激活及其介导的钙超载机制： 空间和单细胞分析一致显示，Piezo1、Ryr2和Mmp2在梗死区和不完全梗死区的基因表达均特异性上调，而Serca2则下调。通过整合scRNA-seq与RCTD，研究者识别出8个心肌细胞亚群，其中亚群CM7是Piezo1的主要来源。伪时间轨迹分析将心肌细胞分为5个状态，并发现模块2中的基因在一条终末分支上随伪时间显著升高，该模块显著富集了钙介导的心脏收缩调节和对机械刺激的反应等功能。同时，Piezo1的表达也在该轨迹上呈现逐步上升趋势，尤其以CM7亚群的增加最为显著。这些发现表明，Piezo1在特定的心肌细胞亚群中被动态激活，驱动了损伤进程中的机械转导。蛋白水平上，Western blot和免疫荧光验证了Piezo1、RyR2和MMP2的显著上调以及SERCA2的下调。体外功能验证实验证实，H/R处理导致H9c2细胞内Ca²⁺显著蓄积；使用Piezo1抑制剂GsMTx4能有效减弱H/R诱导的Ca²⁺升高，而激动剂Yoda1则增强Ca²⁺内流。以上结果构建了一个Piezo1通过活化MMP2–RyR2/SERCA2信号轴介导钙超载，最终导致MIR损伤的潜在模型。
五、研究结论与价值
该研究首次精细描绘了MIR损伤后左心室梗死核心、不全梗死区及其边界区的空间转录组异质性与细胞组成差异。研究发现，铁死亡是梗死核心区域的显著细胞死亡模式，而不全梗死区则以MAPK、IL-17通路主导的炎症反应为特征。研究的关键贡献在于，整合空间与单细胞转录组学数据，揭示了机械敏感通道Piezo1在特定心肌细胞亚群的时空动态激活，并证明其通过扰乱MMP2–RyR2/SERCA2轴导致致命的钙超载。这些成果不仅为理解MIR损伤的区域性分子病理机制提供了全新视角，也为开发针对Piezo1的早期干预策略以保护心肌、防止梗死面积扩大提供了坚实的理论基础和潜在的药物靶点。
六、研究亮点