本研究由Samuel M. Goodfellow、Robert A. Nofchissey、Kurt C. Schwalm、Joseph A. Cook、Jonathan L. Dunnum、Yan Guo、Chunyan Ye、Gregory J. Mertz、Kartik Chandran、Michelle Harkins、Daryl B. Domman、Darrell L. Dinwiddie及Steven B. Bradfute等研究人员共同完成。他们主要来自美国新墨西哥大学健康科学中心全球健康中心、儿科系、西南生物学博物馆、综合癌症中心，以及阿尔伯特·爱因斯坦医学院微生物与免疫学系等机构。该研究成果以题为“Tracing Transmission of Sin Nombre Virus and Discovery of Infection in Multiple Rodent Species”的学术论文形式，于2021年12月发表在*Journal of Virology*第95卷第23期。
该研究属于病毒学，特别是新发人兽共患病病毒流行病学领域。辛诺柏病毒（Sin Nombre orthohantavirus, SNV）是布尼亚病毒目汉坦病毒科的一种负链单股RNA病毒，其主要宿主为北美鹿鼠（*Peromyscus maniculatus*）。人类通过吸入感染鼠类气溶胶化的排泄物而感染SNV，可导致汉坦病毒心肺综合征（Hantavirus cardiopulmonary syndrome, HCPS），病死率高达约36%。自1993年美国“四角区”首次爆发以来，北美，特别是新墨西哥州，报告了最多的HCPS病例。尽管已知鹿鼠是SNV的主要宿主，但之前的研究多基于血清学检测，存在与其它非致病性汉坦病毒交叉反应的可能，且除鹿鼠外，其他啮齿动物体内是否存在SNV感染并可能成为潜在宿主或传播者，尚未通过基因组测序得到充分证实。传统观点认为SNV的传播动态主要取决于其单一宿主（鹿鼠）的种群生物学特征。然而，如果存在多个宿主物种，病毒传播循环和溢出至人类的风险将更为复杂。因此，本研究的核心目标是：利用分子和基因组学工具，追溯一例人类SNV感染的源头；并通过对潜在暴露点捕获的啮齿动物进行系统筛查，探究除鹿鼠外，其他啮齿动物物种是否携带SNV，从而更深入地理解SNV的宿主分布和传播风险。
研究遵循了从病例确认、现场调查、实验室检测到基因组分析的系统性工作流程，主要包含以下几个紧密衔接的步骤。
步骤一：病例确认与临床诊断。 研究对象为一例来自新墨西哥州北部的57岁男性HCPS患者。研究人员首先通过逆转录定量聚合酶链式反应（Reverse transcriptase quantitative PCR, RT-qPCR）检测患者血清、全血和血浆中的SNV S片段RNA，所有样本均呈阳性，从而分子学确诊了SNV感染。同时，临床评估符合HCPS的诊断标准。为量化病毒载量，研究构建了含有SNV N基因的质粒标准品，绘制了标准曲线（R²=0.998），计算出患者样本中的病毒基因组拷贝数，其水平与既往文献报道的感染者相当，为后续研究提供了明确的病原学基础。
步骤二：潜在暴露点现场调查与样本采集。 根据患者自述，其在症状出现前2-3周曾清理过两个地点的棚屋（两地相距约15英里），均发现有鼠类侵扰和粪便。研究团队在这两个潜在暴露点（标记为Site 1和Site 2）进行了为期两夜的野外捕获。共捕获69只啮齿动物，收集了包括肺组织在内的多种组织样本，并制备了完整的博物馆馆藏标本，记录了形态测量和生态数据。物种鉴定通过形态特征和细胞色素b基因测序进行确认。捕获的物种包括已知宿主北美鹿鼠、白足鼠属的另一种（Peromyscus boylii, 松林小鼠）、小家鼠（*Mus musculus*）、墨西哥林鼠（*Neotoma mexicana*）以及最小花栗鼠（*Tamias minimus*）。
步骤三：啮齿动物样本的SNV筛查。 对全部69只啮齿动物的肺组织提取RNA，使用与检测患者样本相同的SNV特异性TaqMan引物和探针进行RT-qPCR检测，以鉴定潜在的病毒宿主。这是一个关键的筛选步骤，旨在从大量样本中快速识别出SNV阳性的个体，为后续基因组测序提供目标样本。
步骤四：病毒全基因组测序与系统发育分析。 此步骤是本研究方法学上的核心。为了追溯传播链并确认不同宿主携带的病毒是否为SNV，研究人员对患者样本（全血和血浆）以及筛选出的8个啮齿动物样本（每个地点4个）进行了病毒全基因组测序（Whole-genome sequencing, WGS）。他们开发并应用了一种新颖的“多重PCR平铺”方案，该方法最初为寨卡病毒设计，本研究将其改造适用于SNV。该方案通过设计覆盖整个SNV基因组（S、M、L三个片段）的多重引物池，进行长片段扩增，然后利用牛津纳米孔GridION X5测序平台进行测序。对于部分覆盖度不足的区域，辅以Sanger测序进行填补。这是一种适用于直接从临床或环境样本中获取低丰度病毒基因组的有效策略。获得的序列通过生物信息学流程进行处理，与SNV参考基因组（NMH10）比对后生成一致序列。接着，研究人员将本研究获得的SNV基因组与从NCBI获取的多个参考序列（包括来自不同地区的SNV毒株及其他汉坦病毒）进行比对，使用MEGA-X软件构建基于S、M、L片段串联的最大似然法系统发育树，并通过高自举值支持节点可靠性，以分析病毒之间的遗传关系。
研究取得了多方面的重要结果，这些结果环环相扣，共同支撑了最终的结论。
在啮齿动物筛查方面，RT-qPCR结果显示，总体捕获啮齿动物中有38%（26/69）的肺组织呈SNV RNA阳性，感染率相当高。其中Site 1的阳性率为39%，Site 2为35%。尤为重要的是，阳性检出不仅限于已知宿主北美鹿鼠（41%的捕获鹿鼠阳性），还扩展到了其他物种：包括松林小鼠（P. boylii, 2/4阳性）、小家鼠（M. musculus, 3/9阳性），以及最值得注意的是最小花栗鼠（T. minimus, 4/11阳性）。而捕获的墨西哥林鼠全部为阴性。这一发现直接挑战了SNV仅由北美鹿鼠主要携带的传统认知，首次通过分子检测（RT-qPCR）证实了在同一个已知人畜共患感染的地理区域内，多种啮齿动物物种的肺部存在SNV感染。
在病毒基因组学与传播溯源方面，测序获得了患者和啮齿动物样本中SNV的部分至近乎完整的基因组（覆盖度47%-99%）。系统发育分析显示，本研究所有样本（包括患者和不同啮齿动物来源）的SNV基因组聚集在一个共同的进化支内，明显区别于来自加利福尼亚州等其他地区的SNV毒株，显示了地理上的遗传分化。关键发现是，患者血液中的SNV基因组与在Site 1捕获的两只北美鹿鼠（编号tr008和tr016）体内的SNV基因组形成了一个紧密的簇。其中tr016正是在患者经常出入的棚屋内捕获的。这一遗传学上的高度相似性强烈暗示，患者的感染很可能源于Site 1，而非Site 2。研究还分析了不同样本间病毒蛋白的氨基酸变异，发现患者毒株与Site 1鹿鼠毒株共享一些独特的氨基酸变化，而与Site 2的毒株存在差异，进一步支持了Site 1为传播源头的推断。这是首次利用SNV全基因组测序成功追溯并定位可能的人类感染地点。
关于多物种感染的意义，研究人员成功从一只阳性松林小鼠（tr009）、一只阳性小家鼠（tr057）和一只阳性花栗鼠（t2058）中获得了部分SNV基因组序列（约50-60%）。系统发育分析（无论是基于串联片段还是单个片段）均一致表明，这些来自非鹿鼠物种的病毒序列并非其他已知的汉坦病毒，而是明确地与本研究中患者和鹿鼠的SNV序列聚类在一起。这提供了确凿的基因组证据，证明在这些新发现的啮齿动物宿主中循环的病毒就是SNV本身，而不是血清学交叉反应所暗示的其他病毒。这一结果首次报告了在非鹿鼠啮齿动物中进行SNV大规模基因组测序的数据，证实了在人类感染现场，SNV可以同时感染多种啮齿动物。
本研究的结论具有多重科学价值和实际意义。主要结论是： 1. 通过整合RT-qPCR筛查和病毒全基因组测序，成功实现了一例人类SNV感染的分子流行病学溯源，将感染源头定位到患者住所附近（Site 1）的特定鼠类活动区域。2. 在新墨西哥州一个人畜共患感染现场，不仅在高比例的北美鹿鼠中检测到SNV，还首次通过基因组学证据确凿地发现SNV能同时感染松林小鼠、小家鼠和最小花栗鼠。这提示SNV可能存在比先前认知更广泛的宿主范围。
科学价值方面： 本研究展示了病毒全基因组测序在追踪SNV等人兽共患病病原体传播中的强大能力，为分子流行病学提供了新的工具范本。研究结果改变了人们对SNV宿主特异性的理解，揭示其可能是一种在多宿主啮齿动物群落中循环的病毒。这对构建更准确的SNV生态学和传播风险模型至关重要，因为病毒动态可能不再仅仅依赖于单一宿主（鹿鼠）的种群波动，而是受到多种啮齿动物物种共存、竞争和相互作用的影响。研究还提示，病毒在不同物种间的“溢出”事件可能比想象的更常见，需要进一步探究这些新发现的宿主是病毒的“死胡同”宿主，还是能够维持病毒循环并参与传播的有效储存宿主。
应用价值方面： 研究对公共卫生和感染控制具有直接启示。发现多种常见啮齿动物（特别是与人居环境紧密相关的小家鼠和活动范围广泛的花栗鼠）可能携带SNV，意味着传统的以防控鹿鼠为主的风险管理策略可能需要调整。在疾病流行区，公共卫生教育应强调对所有啮齿动物及其排泄物的普遍防护，而不仅仅针对特定物种。此外，基因组溯源方法可用于未来疫情调查，快速识别高风险地点和活动，从而实施精准的干预措施。
本研究的亮点在于： 1. 方法学创新： 首次将病毒全基因组测序应用于SNV的传播链追踪，并成功将人类临床分离株与野外捕获的啮齿动物宿主病毒在基因组水平关联起来。2. 重要发现： 首次提供了SNV能够感染并存在于多种非传统宿主啮齿动物（包括花栗鼠）肺组织中的直接基因组证据，拓展了对SNV宿主生态学的认知边界。3. 研究设计的系统性： 从临床病例出发，结合精细的现场生态学调查、高灵敏度分子筛查和高分辨率基因组学分析，形成了一个完整的研究闭环，论证严密。4. 对传统血清学研究的补充与超越： 通过基于RNA的检测和测序，避免了抗体交叉反应带来的假阳性问题，提供了更可靠的感染证据。
其他有价值的细节包括研究也指出了局限性，例如从野外组织样本中获取的病毒基因组覆盖度不完全（与病毒载量即Ct值相关），这为未来优化直接从环境样本中测序病原体基因组的技术提供了改进方向。此外，研究提出了未来需要解答的关键问题：这些新发现的感染SNV的啮齿动物是否能有效通过排泄物传播病毒？它们体内的病毒对人类是否具有相同的致病性？这些问题对于评估这些物种在SNV传播中的实际角色至关重要。这项研究通过前沿的基因组学工具，深刻揭示了SNV复杂的人畜共患传播画面，为预防和控制这种致命疾病提供了新的科学依据。