《化学工程科学》（*Chemical Engineering Science*）期刊上一项关于工业规模青霉素发酵过程建模与缩尺设计的综合研究报告

本研究的主要作者为来自荷兰代尔夫特理工大学的Peng Wei、Cees Haringa、Luis M. Portela以及来自皇家帝斯曼集团的Henk J. Noorman。他们合作完成的论文《用于结合溶氧与葡萄糖浓度动态变化的工业青霉素产黄青霉发酵的代谢-流体动力学模型构建与缩尺设计》（Metabolic-fluid dynamics model construction and scale-down design for an industrial penicillin chrysogenum fermentation with combined dissolved oxygen and glucose concentration dynamics）发表于2023年的*Chemical Engineering Science*期刊第276卷。

研究背景与目标

本研究隶属于生物化工和发酵工程领域，核心关注点是工业规模生物反应器中环境异质性对微生物代谢和生产效率的影响。在大型发酵罐（如文中所研究的54立方米青霉素发酵罐）中，由于混合不够理想，底物（如葡萄糖）和溶解氧（DO）的浓度在空间上分布不均，形成梯度。微生物在反应器内循环运动时会经历这些不断变化的微环境，这种动态变化会影响其生理状态，进而影响整体工艺性能，特别是目标产物（如青霉素）的生产速率和得率。

为了在实验室规模下理性设计和优化工业过程，研究者需要理解并模拟这种梯度效应。常用的工具是缩尺（Scale-Down, SD）模拟器，其目标是在实验室条件下重现工业规模反应器中存在的代表性环境波动，从而研究其对微生物性能的影响。然而，先前针对青霉素发酵的缩尺研究主要关注葡萄糖梯度，通常采用间歇进料等方式模拟，其波动时间尺度（数十至数百秒）可能远大于计算流体动力学（CFD）模型预测的工业罐内真实的快速波动（秒级）。同时，氧气梯度的潜在影响在以往模型中常被忽略或简化为非限制性条件，尽管多项研究已表明溶解氧浓度对青霉素生产具有重要甚至关键性的影响。

因此，本研究的核心目标是：在先前建立的CFD-细胞反应动力学（CRD）模型框架基础上，进一步整合氧气传递与消耗过程，构建一个能够同时模拟葡萄糖和溶解氧浓度梯度的工业规模代谢-流体动力学耦合模型。通过此模型，旨在深入探究葡萄糖与氧气梯度共同作用对产黄青霉（*Penicillium chrysogenum*）代谢及青霉素生产的具体影响，并基于更真实的“生命线”（lifeline，即单个微生物细胞在反应器中经历的环境参数随时间变化的轨迹）数据，设计出更能代表工业规模快速动态变化的新型缩尺模拟器方案，同时兼顾实验室实现的可行性。

详细研究流程与方法

本研究的工作流程主要分为两大紧密关联的部分：工业规模CFD-CRD耦合模型的构建与模拟，以及基于模拟结果进行的缩尺模拟器设计与分析。

第一部分：工业规模耦合模型的构建与模拟

1. CFD模型设置： 研究基于一个有效容积为54立方米的工业青霉素发酵罐进行建模。模型采用欧拉-欧拉多相流方法模拟通气搅拌流动，使用Realizable k-ε湍流模型和滑动网格模型处理搅拌桨转动。通气条件设定为表观气速0.05 m/s。液相物性简化为与水类似，气相采用理想气体定律和单一气泡尺寸（6.4 mm）假设。氧气从气相到液相的传质系数（kLa）采用了一种混合模型进行计算，即比较Higbie渗透模型和Lamont-Scott涡胞模型的预测值，并选取较大者作为局部传质系数，以同时考虑低湍流区的渗透作用和高湍流区的表面更新效应。

2. 代谢动力学耦合： 在液相中，葡萄糖和氧气的消耗被考虑为耦合过程。研究采用了两种经典的黑箱模型来描述这种耦合动力学：

   • 曹氏与汉森模型（Tsao & Hanson Model）： 该模型通过双Monod方程形式直接将葡萄糖和溶解氧的浓度与各自的比消耗速率相关联（公式1, 2），认为两者相互影响。
   • 罗尔斯模型（Roels Model）： 该模型通过Herbert-Pirt关系式分别计算基于葡萄糖和基于氧的比生长速率，并取二者中的较小值作为实际的比生长速率（公式3, 4），进而推导底物消耗。青霉素的生产速率计算还考虑了葡萄糖对青霉素基因簇的阻遏效应。

   所有与氧气相关的动力学参数均取自文献。此外，还模拟了一个氧气供应无限的情景作为参照。微生物的生物量浓度设定为恒定的55 g/L，在模拟的时间尺度（分钟级）内忽略其生长和体积变化。

3. 生命线数据获取与分析： 采用欧拉-拉格朗日方法，将微生物视为液相中的无质量颗粒，追踪大量（20,000个）颗粒在900秒流动时间内的运动轨迹，以秒级分辨率（采样步长0.03秒）记录每个颗粒经历的局部葡萄糖浓度和溶解氧浓度，从而生成“生命线”数据。基于此，研究重新定义了代谢区域（Metabolic Regime）。在先前仅考虑葡萄糖（根据比摄取速率qs/qs_max划分为过剩、限制、饥饿）的基础上，引入了溶解氧阈值（0.05 mmol/L，基于文献中青霉素生产速率急剧下降的浓度）。两者组合，形成了六个代谢区域：例如，“L+”代表葡萄糖限制且溶解氧充足，“L-”代表葡萄糖限制且溶解氧不足，等等。通过对生命线数据进行统计，分析了微生物在不同区域内的停留时间分布、区域间转换的模式及其逻辑序列。

4. 长期性能预测： 将上述CFD模拟获得的动态生命线数据（短期波动）输入到一个结构化的9库代谢模型中，该模型描述了从秒到天的细胞内代谢动力学。通过随机连接短期生命线生成长达80小时的虚拟生命线，来预测长期的、稳态的青霉素生产速率，从而评估环境梯度对最终生产性能的宏观影响。

5. 假设性情景与敏感性分析： 除了基准工况（正常葡萄糖进料速率），研究还探讨了更严苛的假设情景，例如将葡萄糖进料速率加倍，以模拟更强的底物-氧气限制。同时，还简要分析了搅拌速度、气泡尺寸、 broth流变学等参数变化对氧气传递速率（kLa）估计的敏感性，以凸显模型对关键参数的不确定性。

第二部分：缩尺模拟器设计

基于工业规模CFD模型生成的、包含氧气耦合效应的生命线数据特征，研究提出了三种缩尺模拟器设计方案，并对其代表性和可实现性进行了评估。

1. SD-A（高保真随机设计）： 此设计延续了作者团队先前的工作思路，旨在高度精确地复现生命线数据。它采用单罐连续操作模式，但要求较高的生物量浓度（27.5 g/L）以实现快速的底物消耗和波动。葡萄糖的“盛宴-饥饿”事件和氧气的“供应-中断”事件均基于对工业生命线数据进行“弧分析”（arc-analysis）得到的统计规律（如波动幅度、持续时间、模式转换概率）进行随机化构建和连接。此设计理论上能很好地匹配工业模型预测的区域分布和模式转换概率（偏差%），但其操作极其复杂，需要高度随机和频繁切换的进料与通气控制，实验室实现非常困难。

2. SD-B（基于传统实验的改进设计）： 此设计基于以往文献中报道的、相对容易实现的缩尺实验方案（如de Jonge et al., 2011），采用较低生物量浓度（6 g/L）。其基本周期包含一个非重叠的葡萄糖饥饿阶段和一个溶解氧饥饿阶段。研究首先评估了这种传统方案在模拟更严苛假设工况时的表现，发现其预测的代谢区域分布与工业CFD结果存在显著差异。即使优化进料速率和通气时间，也只能部分匹配某些区域，且始终无法消除工业模型中未出现的“S-”（葡萄糖和溶解氧双饥饿）区域。此外，由于生物量低、消耗慢，其操作周期长（分钟级），无法复现工业模型预测的秒级快速波动。

3. SD-C（新型折衷设计）： 为了在代表性和可实现性之间取得平衡，本研究提出了一种新的缩尺模拟器设计方案（SD-C）。它采用周期性循环而非完全随机操作，但循环内包含了更复杂的步骤序列。设计基于工业生命线数据分析得到的六个区域转换模式的平均停留时间、发生概率和逻辑序列。如图3所示，一个完整的SD-C周期被划分为六个步骤，分别对应不同模式转换的频繁发生（如步骤1模拟L+与L-间的快速切换，步骤4模拟L+与S+间的快速切换）以及不同模式组之间的连接（步骤2,3,5,6）。每个步骤内，葡萄糖进料和空气供应的开关模式、持续时间、流速都经过精心设计（表5，图4b），以在单罐、理想混合的假设下，驱动整个培养物经历类似于工业规模中部分微生物所经历的环境变化序列。SD-C要求相对较高的生物量浓度（20 g/L），并在一个周期内实现了对葡萄糖和溶解氧条件的频繁、快速切换（图4a）。

主要研究结果

1. 氧气耦合对代谢区域分布的影响： 耦合氧气效应显著改变了仅考虑葡萄糖时的代谢区域图景。使用Tsao & Hanson模型（正常进料）时，预测的反应器内完全不存在葡萄糖过剩区域（E+或E-），并且出现了相当比例（14.8%）的溶解氧限制区域（L-），这对青霉素生产是不利的。相反，Roels模型的预测则显示存在葡萄糖过剩区域，且氧气限制区域比例很小（4%）。这凸显了选择恰当的氧气耦合动力学模型对于准确预测工业梯度至关重要，而目前缺乏实验数据来验证哪种模型更符合实际。

2. 梯度方向与青霉素生产： 在Tsao & Hanson模型中，由于葡萄糖从顶部加入而氧气从底部通入，形成了相反的浓度梯度：顶部葡萄糖高但溶解氧可能不足，底部溶解氧相对充足但葡萄糖可能饥饿。与氧气无限的情景相比，氧气耦合降低了葡萄糖摄取的梯度强度，减少了葡萄糖饥饿区域，但同时也消除了可能因葡萄糖阻遏减轻而对青霉素生产有利的过剩区域。通过9库代谢模型进行的长期预测表明，氧气耦合情景下的青霉素生产速率比氧气无限情景低约5%。这定性地符合先前实验观察——低溶解氧会降低青霉素产量，尽管9库模型本身并未直接包含氧气的代谢作用。

3. 生命线动态特征： 对重新定义的六个代谢区域的分析表明，微生物经历着极其快速（秒到十秒级）的区域间转换。六个区域转换模式被识别出来（表2，图2a），它们的停留时间分布大致呈指数衰减趋势，表明反应器内每个区域都存在流体力学意义上的循环。这些快速波动是传统缩尺实验（采用分钟级周期）通常无法捕捉的。

4. 缩尺设计比较与SD-C的性能： 分析表明，SD-A虽能高保真复现CFD结果，但实验室实施难度极高；SD-B（传统方法）由于操作时间尺度大、模式单一，本质上无法充分代表工业规模预测的快速波动和复杂区域分布。新提出的SD-C设计则在代谢区域分布的匹配上取得了显著改进（表4），其预测的S-区域极少，L-、L+、S+区域的比例与CFD结果接近。SD-C生成的生命线（图4a）展示出了与工业模型相似的快速波动特征。

5. 操作启示与挑战： 研究总结了在缩尺实验中调控代谢区域比例的一些启示。例如，要最小化不希望出现的S-区域，需要将通气启动和时间尺度与葡萄糖进料阶段紧密耦合，并保持适中的进料速率。研究也坦承，实现SD-C方案存在重大挑战：需要高生物量浓度、对进料和通气进行频繁且精确的程序控制、可能需要使用纯氧或微孔曝气器以减少所需的气体流量等。研究还探讨了多罐（如四区室）或微流控反应器作为替代方案的可能性，但也指出了它们各自在复杂性、细胞损伤风险或群体代表性方面的局限性。

研究结论与价值

本研究的核心结论是，在工业规模青霉素发酵的建模中，同时考虑葡萄糖和溶解氧的耦合梯度效应至关重要，这会显著改变对微生物所处代谢状态和整体工艺性能的预测。研究通过CFD-CRD耦合建模，首次在工业尺度上详细刻画了产黄青霉同时经历葡萄糖和溶解氧快速动态变化的“生命线”，并据此定义了六个耦合代谢区域。

研究的科学价值在于推动了生物反应器“尺度缩小”方法论的发展。它明确指出，为了更真实地在实验室模拟工业过程，需要将缩尺实验的操作波动时间尺度从分钟级大幅缩短至秒级，并设计更复杂的操作序列来模拟空间梯度转化而来的时间序列变化。研究提出的SD-C设计方案为实现这一目标提供了一个具体的、基于机理的框架。

其应用价值在于为工业发酵过程的优化和故障诊断提供了更精细的工具。模型可以用于评估不同操作条件（如进料策略、搅拌通气强度）对罐内微环境及最终产品产量的影响，辅助工艺设计和放大。同时，研究对模型参数（特别是氧气相关参数）敏感性的分析，也指明了未来需要重点通过实验获取的关键数据领域，如工业规模下的真实流体力学特性、 broth流变学及准确的氧摄取动力学。

研究亮点与创新

1. 首创性耦合模型： 首次在工业规模青霉素发酵的CFD-CRD模型中系统性地整合了葡萄糖与溶解氧的耦合传递、消耗动力学及其对代谢区域的影响。
2. 精细化的生命线分析： 基于双重阈值（葡萄糖摄取能力与溶解氧浓度）定义了六个代谢区域，并对耦合梯度下的微生物生命线动态进行了深入的统计学和模式分析，为缩尺设计提供了前所未有的详细依据。
3. 前瞻性的缩尺设计框架： 提出的SD-C缩尺模拟器设计，超越了传统的简单周期操作，引入了基于模式概率和逻辑序列的复杂周期性操作程序，在代表性与可实现性之间寻求了有意义的平衡，为未来开发新型、高效的实验室缩尺工具指明了方向。
4. 强调快速动力学的重要性： 研究反复强调并证实了工业罐内微生物经历的是秒级环境波动，这对当前普遍采用较慢波动时间尺度的缩尺实验提出了根本性质疑，具有重要的启发意义。

其他有价值内容

研究附录中的补充材料（Table S1, S2, S3, Fig. S1）提供了SD-B实验设置的细节、模型参数敏感性分析的具体数据、各区域转换模式的统计参数以及四区室缩尺反应器的设计示意图，这些内容对完整理解研究和进行后续工作具有重要参考价值。研究也明确声明了数据的获取限制和潜在的利益冲突（无）。