研究论文报告

作者与发表信息

本研究由Kuanlin Wu、Hanzhi Wu、Wanqing Lyu、Youngjoo Kim、Cristina M. Furdui、Karen S. Anderson及Anthony J. Koleske共同完成。主要研究机构包括耶鲁大学分子生物物理与生物化学系、维克森林医学院内科学部分子医学组、耶鲁大学药理学系及神经科学系。该论文发表于 *Journal of Biological Chemistry*，于2021年3月16日投稿，2021年6月7日修订，2021年6月16日在线发表，DOI为10.1016/j.jbc.2021.100883。

学术背景

Abl家族非受体酪氨酸激酶（nonreceptor tyrosine kinases）包括Abl1和Abl2，它们将生长因子和黏附受体的信号转化为细胞骨架的重组与重塑，对细胞形态发生、黏附、迁移、内吞、吞噬及DNA损伤应答等过程至关重要。Abl家族激酶的催化活性受到严格的分子内和分子间相互作用以及翻译后修饰的调控。在非激活状态下，Abl激酶通过自抑制构象维持低活性，其中SH3（Src同源3）结构域和SH2（Src同源2）结构域与激酶结构域之间的连接区形成刚性的分子内相互作用。血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ）是Abl家族激酶的强效激活因子，Abl激酶介导PDGF诱导的背侧膜皱褶形成、细胞增殖和趋化作用。然而，PDGFRβ如何结合并激活Abl家族激酶的分子机制尚不清楚。本研究的目的是揭示PDGFRβ与Abl2相互作用的分子界面、鉴定PDGFRβ磷酸化Abl2的具体位点，以及阐明这些磷酸化事件如何导致Abl2激酶活性的激活。

研究流程与实验方法

本研究采用了体外生化实验与细胞实验相结合的策略，主要分为以下几个阶段：

第一阶段，研究人员首先在HEK293细胞中表达野生型或激酶失活的PDGFRβ，用PDGF-BB刺激诱导受体自磷酸化，然后利用偶联了Abl2 SH2结构域的琼脂糖珠进行下拉实验。同时使用了SH2结构域磷酸酪氨酸结合缺陷突变体（R198K）作为对照。通过定点突变将PDGFRβ胞内结构域中的特定酪氨酸残基（Y716、Y751、Y771）突变为苯丙氨酸，以确定SH2结构域的结合位点。为进一步验证直接结合，研究人员纯化了重组PDGFRβ胞内结构域（氨基酸554–1106）和Abl2 SH2结构域，测量了结合亲和力（KD值）。

第二阶段，研究人员构建并纯化了多种重组Abl2蛋白片段，包括全长Abl2（氨基酸74–1182）、Abl2 N端片段（氨基酸74–557）和Abl2 C端片段（氨基酸557–1182），这些蛋白在昆虫细胞中通过杆状病毒系统表达。Abl2 N端片段携带激酶失活突变（D307N和K317M）以排除Abl2自身磷酸化的干扰。通过放射性ATP激酶实验检测PDGFRβ是否直接磷酸化Abl2及其不同片段。实验条件包括5 nM PDGFRβ胞内结构域与0–2 μM的Abl2底物在32°C下预孵育5分钟，然后加入含[γ-32P]ATP的反应体系进行10分钟。

第三阶段，为鉴定PDGFRβ磷酸化Abl2的具体位点，研究人员将体外磷酸化的Abl2 N端蛋白进行质谱磷酸化肽段分析。样品先经DTT还原和碘乙酰胺烷基化，胰蛋白酶消化过夜，使用TiO2亲和柱富集磷酸化肽段，然后通过LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）在Thermo Scientific Orbitrap Velos Pro质谱仪上进行分析。数据使用Proteome Discoverer 2.5软件和SEQUEST HT算法进行数据库搜索。同时，研究人员构建了多个Abl2亚片段（SH3-SH2串联结构域、含SH2-激酶连接区的SH2片段、激酶结构域）及相应的酪氨酸到苯丙氨酸突变体，通过放射性激酶实验验证质谱鉴定的磷酸化位点。

第四阶段，研究人员建立体外激酶激活实验体系。将1 μM的Abl2 N端蛋白与10 nM PDGFRβ胞内结构域在含ATP的条件下预孵育2小时使Abl2被磷酸化，然后测定激活后的Abl2对其底物CrkII的磷酸化动力学参数（Km和kcat）。构建了4YF突变体（Y116F、Y161F、Y272F、Y310F）和5YF突变体（增加Y439F），以评估各磷酸化位点对Abl2激活的贡献。

第五阶段，在细胞水平验证PDGFRβ对Abl2的结合和磷酸化。在HEK293细胞中共表达PDGFRβ和HA标记的Abl2，通过免疫共沉淀实验检测两者的相互作用及Abl2的酪氨酸磷酸化水平。此外，利用CRISPR/Cas9技术在小鼠3T3成纤维细胞中敲除Abl1和Abl2基因，检测PDGF刺激后CrkII磷酸化水平的变化，以验证PDGFRβ信号通路在细胞内对Abl激酶活性的调控。

主要研究结果

在结合实验方面，研究发现Abl2 SH2结构域能特异性结合自磷酸化的PDGFRβ。Y771F突变使PDGFRβ与Abl2 SH2结构域的结合减少了90%，而Y751F突变仅减少10%。体外实验显示，纯化的自磷酸化PDGFRβ胞内结构域与Abl2 SH2结构域的解离常数KD为0.26 ± 0.07 μM，而未磷酸化的PDGFRβ仅表现出微弱的背景结合。SH2结构域R198K突变体完全丧失了与自磷酸化PDGFRβ的结合能力。这些结果证明Abl2 SH2结构域直接结合PDGFRβ上磷酸化的Y771残基。

在磷酸化实验方面，PDGFRβ胞内结构域能够直接磷酸化全长Abl2和Abl2 N端片段，但对Abl2 C端片段的磷酸化作用非常微弱。SH2结合缺陷的Abl2 N端R198K突变体的磷酸化程度显著降低，表明SH2介导的Abl2招募至PDGFRβ是其被磷酸化的必要条件。质谱分析鉴定出七个酪氨酸磷酸化位点：Y116、Y139和Y161位于SH3结构域，Y272位于SH2-激酶连接区，Y299、Y303和Y310位于激酶结构域，以及Y439位于激酶激活环。突变验证实验证实了这些位点的重要性：单独的Y272F突变完全消除了Abl2 SH2片段的磷酸化；SH3结构域三重突变（Y116F/Y139F/Y161F）显著降低了SH3-SH2片段的磷酸化；激酶结构域的四重突变（Y299F/Y303F/Y310F/Y439F）也显著降低了激酶结构域的磷酸化。值得注意的是，Y116、Y161、Y272和Y310均位于SH3/SH2-激酶连接区界面附近，该界面对于维持Abl家族激酶的自抑制构象至关重要。

在激酶激活实验方面，PDGFRβ磷酸化后的Abl2 N端激酶催化效率（kcat/Km）达到3.15 μM⁻¹min⁻¹，相比未激活状态的0.55 μM⁻¹min⁻¹提高了5.7倍，比仅自磷酸化的0.83 μM⁻¹min⁻¹提高了3.8倍。然而，4YF和5YF突变体在PDGFRβ处理后均未能被激活，表明Y116、Y161、Y272和Y310这四个位点的磷酸化对于Abl2的激活不可或缺。值得注意的是，即使在4YF突变体中恢复了Y439，PDGFRβ也不能在该突变体上磷酸化Y439，说明当Abl2 N端处于较少磷酸化状态时，激活环的Y439无法被有效磷酸化。

在细胞实验中，PDGF刺激后，表达野生型PDGFRβ的细胞中Abl2酪氨酸磷酸化水平增加了2.2倍，而表达激酶失活PDGFRβ或SH2结合缺陷Abl2 R198K突变体的细胞中未观察到类似的增加。免疫共沉淀实验确认PDGFRβ与Abl2在PDGF刺激后形成复合物。在小鼠3T3成纤维细胞中，PDGF刺激导致Abl底物CrkII的磷酸化增加8倍，而CRISPR敲除Abl1和Abl2的双敲除细胞中这种增加几乎完全消失。

结论与意义

本研究首次阐明了PDGFRβ结合、磷酸化并激活Abl2激酶的完整分子机制。Abl2通过其SH2结构域识别PDGFRβ上磷酸化的Y771位点被招募至受体。随后PDGFRβ直接磷酸化Abl2 N端的多个酪氨酸位点，特别是位于SH3/SH2-激酶连接区界面的Y116、Y161、Y272和Y310。这些磷酸化事件通过破坏Abl2的自抑制构象，推动激酶向激活构象转变，从而激活Abl2的催化活性。本研究揭示了一个多步骤的Abl激酶激活过程，即Abl激酶并非通过简单的“开关”机制在闭合和开放状态之间切换，而是通过多种分子间/分子内相互作用和翻译后修饰在活性谱上受到精细调控。该发现为理解受体酪氨酸激酶如何通过不同的磷酸化事件激活Abl家族激酶提供了框架，并提示其他激活Abl家族激酶的细胞受体（如EGFR和整合素）可能采用类似的招募和激活机制。从应用价值角度看，PDGFRβ-Abl信号通路在乳腺癌芳香化酶抑制剂耐药性的发展中起重要作用，本研究揭示的分子机制可能为靶向该通路的治疗策略提供新思路。

研究亮点

本研究的核心亮点包括：第一，首次确定了Abl2 SH2结构域与PDGFRβ上磷酸化Y771的直接结合界面，并测定了其亚微摩尔级别的亲和力。第二，通过质谱和突变验证相结合的方法，鉴定出多个新的Abl2磷酸化位点，特别是Y116、Y161、Y272和Y310这四个位于自抑制构象关键界面的位点。第三，通过体外激酶激活实验和突变分析，证明了这些位点的磷酸化对于PDGFRβ介导的Abl2激活是必需的，且激活环Y439的磷酸化依赖于N端结构域的预先磷酸化状态。第四，提出了“破坏SH3/SH2-激酶连接区相互作用可能是Abl激酶激活的通用机制”这一重要假说，为理解Abl家族激酶的多步骤激活过程提供了新的理论框架。