本文属于类型a，即单项原始研究论文。以下是根据该研究撰写的学术报告。
本研究由Sai Kiran Sharma、Jonathan M. Glaser、Kimberly J. Edwards、Elaheh Khozeimeh Sarbisheh、Akam K. Salih、Jason S. Lewis和Eric W. Price等人完成。主要研究机构包括美国纪念斯隆凯特琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center）放射学系、加拿大萨斯喀彻温大学（University of Saskatchewan）化学系以及威尔康奈尔医学院（Weill Cornell Medical College）等。该研究于2021年7月21日发表在期刊《Bioconjugate Chemistry》上，文章标题为“A systematic evaluation of antibody modification and 89Zr-radiolabeling for optimized immuno-PET”。
本研究属于核医学与分子影像领域，聚焦于免疫正电子发射断层显像（immuno-PET）技术中抗体修饰与放射性标记的优化问题。免疫PET是一种利用放射性核素标记抗体对肿瘤等靶点进行无创成像的强大工具。在众多放射性核素中，锆-89（89Zr，zirconium-89）因其半衰期（约78.4小时）与抗体在体内的药代动力学特征相匹配而受到广泛关注。目前临床前和临床研究中应用最广泛的89Zr标记方法是使用双功能螯合剂去铁胺（DFO，desferrioxamine）的异硫氰酸酯衍生物p-SCN-Ph-DFO，通过抗体的赖氨酸残基进行非定点偶联，再用89Zr进行放射性标记。然而，关于DFO偶联和89Zr放射性标记过程中涉及的多个变量如何影响最终放射性免疫偶联物的体外及体内行为，此前尚缺乏系统性的评估。本研究的目的即系统考察DFO偶联程度、放射性标记的缓冲液种类、反应体积、抗体质量、放射性活度以及温度和时间等因素对放射化学产率（RCY）、摩尔活度（Am）、免疫反应分数（immunoreactive fraction）以及体内生物分布和肿瘤靶向能力的影响。
研究的第一阶段为抗体的DFO偶联与表征。作者选择了靶向人表皮生长因子受体2（HER2）的抗体曲妥珠单抗（trastuzumab）作为模型抗体。通过在偶联反应中使用5、10、20、60和200摩尔当量的p-SCN-Ph-DFO，合成了五种DFO偶联物，分别命名为T5、T10、T20、T60和T200。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS/MS）测定每个抗体上平均偶联的DFO数目。结果表明，使用5和10摩尔当量DFO时，每个抗体上平均偶联约1.4个DFO；使用20摩尔当量时约为2.8个；而使用60和200摩尔当量时，每个抗体上的DFO数目均达到约10.9个。还原条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示，随着偶联当量的增加，抗体重链和轻链的迁移逐渐变慢，表明DFO修饰程度增加，且高当量偶联可修饰到轻链区域。
第二阶段为体外免疫反应性评估。采用基于HER2过表达SKOV3细胞的放射配体结合实验测定各偶联物的免疫反应分数。结果显示，T5、T10和T20偶联物的免疫反应分数均较高，而T60和T200相比T5仅下降约10%，差异不具有统计学显著性。然而，表面等离子体共振（SPR，surface plasmon resonance）分析揭示了更细微的差异。动力学分析表明，所有偶联物对重组HER2的结合亲和力仍处于亚纳摩尔级，但T60和T200的平衡解离常数（KD）较未修饰抗体降低了约3.5至4.6倍，并且其结合速率（on-rate）显著减慢。更为重要的是，无校准浓度分析（CFCA，calibration-free concentration analysis）显示，未修饰曲妥珠单抗的活性抗体浓度仅为紫外分光光度法测定浓度的70%，T5为65%，T10为60%，T20为50%，而T60和T200则分别仅为35.5%和44.5%。这表明高程度DFO偶联显著降低了抗体的功能性活性浓度，而传统的细胞结合实验未能有效预测这一变化。
第三阶段为89Zr放射性标记条件的系统评价。首先考察了反应时间和温度的影响。在固定使用50 μg抗体、300 μL经Chelex处理的PBS（磷酸盐缓冲液，phosphate buffered saline）和约200 μCi 89Zr的条件下，分别于室温（约22°C）和37°C反应15、30、60分钟。结果显示，除T5在室温15分钟时放射化学产率低于90%外，其余条件下所有偶联物的放射化学产率均超过90%，其中在37°C反应15分钟或室温反应60分钟时，T5也可获得接近定量的产率。随后考察了抗体质量和反应体积的影响。当使用25 μg或50 μg抗体时，所有偶联物在300 μL体系中均可获得定量放射化学产率；而当抗体质量降至5 μg时，放射化学产率随DFO偶联数目的增加而提高，T5的比活度（specific activity）为17.5 ± 2.2 mCi/mg，T10为27.2 ± 1.5 mCi/mg，T20为32.0 ± 0.2 mCi/mg，T200则高达35.5 ± 1.6 mCi/mg。在反应体积方面，使用0.1 mL反应体积可获得比1.0 mL更高的比活度，表明较小的反应体积有利于提高标记效率。缓冲液筛选实验比较了PBS、经Chelex处理的PBS、HEPES和Tris/HCl缓冲液，结果显示经Chelex处理的PBS在本研究条件下具有最优的放射化学产率，但差异大多不具统计学显著性。脂水分配系数（logD）测定显示，随着DFO偶联数目的增加，抗体的疏水性增加，但该指标并不能预测体内行为。
第四阶段为体内PET成像和生物分布研究。将T5、T10、T20和T200四种放射性标记偶联物分别注射到荷有SKOV3皮下肿瘤的裸鼠体内，在注射后24、72和120小时进行PET成像，并在120小时处死动物进行离体生物分布测定。结果显示，T5、T10和T20在肿瘤中均有较高的摄取，120小时时肿瘤摄取分别为38.6 ± 3.8 %ID/g、42.9 ± 5.1 %ID/g和34.9 ± 8.9 %ID/g，肝脏摄取分别为6.3 ± 1.8 %ID/g、4.6 ± 0.7 %ID/g和6.1 ± 3.4 %ID/g。相比之下，T200的肿瘤摄取显著降低至16.2 ± 3.2 %ID/g，而肝脏摄取显著升高至16.3 ± 6.2 %ID/g，表现出明显劣化的体内性能。这一结果表明，细胞免疫反应性实验和常规SPR亲和力分析未能预测T200的体内表现，而SPR的CFCA分析所揭示的活性浓度下降则与体内趋势一致。
本研究的结论是：DFO偶联程度的增加虽然可提高放射化学产率和比活度，但当每个抗体偶联超过约3个DFO时，会损伤抗体的免疫反应性和体内肿瘤靶向能力。最佳的方案是使用5至10摩尔当量的p-SCN-Ph-DFO进行偶联，使每个抗体携带1至3个DFO，并在低反应体积、经Chelex处理的PBS中、不添加辐射保护剂条件下进行89Zr标记，可获得高比活度且免疫反应性保持较好的放射性免疫偶联物。该研究为免疫PET放射性药物合成中的关键参数优化提供了系统的实验依据，对于低丰度靶点的免疫PET成像具有重要指导意义。
本研究的亮点包括：系统评估了DFO偶联和89Zr标记中的多个变量；发现SPR的CFCA分析比传统细胞结合实验更能预测体内性能；证明了高程度DFO偶联虽然能提高比活度，但会严重损害抗体的体内靶向能力；为免疫PET探针的合成优化提供了可推广的实验策略。此外，作者还指出，对于需要高比活度的免疫PET成像，非定点赖氨酸偶联的高DFO负载策略并不理想，应探索位点特异性偶联或基于树枝状大分子/聚合物的多螯合剂平台等替代策略。