本研究由南京农业大学农业与环境健康中心的Zhi-qiang Zhai、Li-kun Yang、Lin-bin Zhu、Fang-jie Zhao、Wan-ying Xie*和Peng Wang*团队完成，于2025年6月4日发表于期刊*Environ. Health*（2025年第3卷，第931–941页）。
科学领域与背景
抗生素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）是全球公共卫生的重大威胁，而农业活动（如粪肥施用）可能通过传播抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes, ARGs）加剧这一危机。尽管已有研究关注环境中ARGs的扩散，但其从土壤向动物肠道微生物组的迁移机制尚不明确。本研究基于“One Health”理念（强调人、动物与环境微生物组的关联），探索粪肥施用如何通过土壤影响小鼠早期生命阶段的肠道抗性基因组（resistome）。
研究目标
通过模拟农业粪肥施用场景，分析粪肥处理的红壤（Ultisols）和黑土（Mollisols）对幼鼠肠道ARGs的影响，重点揭示ARGs从土壤到动物肠道的传播路径及关键宿主微生物。
1. 土壤样本制备与处理
- 样本来源：红壤采集自广东江门，黑土采集自黑龙江海伦；猪粪堆肥来自河北衡水农场。
- 处理方式：将粪肥以1g/kg（干重）比例施用于两种土壤，设置未施肥对照组。土壤在25℃黑暗条件下培养4周，每周混匀以恢复微生物活性。
- 检测指标：培养后提取土壤DNA，通过高通量测序（Illumina Novaseq平台）分析ARGs和微生物群落。
2. 小鼠实验
- 动物模型：妊娠 BALB/c 小鼠分为四组，分别饲养于红壤（RS）、粪肥红壤（Manured RS）、黑土（BS）、粪肥黑土（Manured BS）作为垫料的环境中。
- 暴露周期：幼鼠从出生至8周龄（性成熟期）持续暴露于对应土壤环境，定期更换垫料以避免交叉污染。
- 样本采集：8周龄时采集粪便，提取DNA进行宏基因组测序。
3. 数据分析方法
- 宏基因组分析：使用MEGAHIT组装序列，Kraken2和Bracken分类微生物群落；Prodigal预测基因开放阅读框（ORFs）；ARGs注释依据CARD数据库（Comprehensive Antibiotic Resistance Database）。
- 抗性基因风险评估：通过ARG-Ranker框架量化ARGs健康风险；MobileOG数据库分析移动遗传元件（Mobile Genetic Elements, MGEs）。
- 宿主溯源：基于宏基因组组装基因组（MAGs）鉴定携带ARGs的关键微生物 taxa（如Muribaculaceae和Bacteroidaceae）。
1. 粪肥显著增加土壤ARGs丰度与多样性
- 丰度提升：粪肥处理使红壤和黑土的ARGs丰度分别增加10.5%和12.5%（p<0.05），其中四环素抗性基因（如tet(q)）富集最显著。
- 多样性变化：Shannon指数表明施肥土壤中ARGs亚型（如rpob2、helr）的多样性显著高于对照组。
2. 粪肥暴露导致小鼠肠道ARGs富集
- 关键基因：暴露组小鼠肠道tet(q)基因丰度比对照组高48.4%（红壤组）和109%（黑土组）。
- 宿主微生物：共现网络分析显示，Muribaculaceae和Bacteroidaceae与tet(q)呈强正相关（Spearman r>0.6），提示它们是ARGs传播的关键载体。
3. 水平基因转移（HGT）证据
- 基因组比对：在MAGs中，发现Muribaculaceae（gut_bin164）和Bacteroidaceae（gut_bin359）携带高度相似的tet(q)基因序列（100%一致性），且其侧翼区域存在与MGEs相关的序列，表明ARGs可能通过HGT在微生物间传播。
4. 健康风险增加
- 致病性关联：粪肥处理组土壤和小鼠肠道中MGEs（如转移相关基因）和毒力因子（Virulence Factors, VFs）的丰度显著升高，暗示ARGs扩散与病原性增强的潜在关联。
科学意义
1. 传播路径验证：首次通过动物模型证实粪肥施用可通过土壤-肠道途径促进ARGs的跨物种传播，尤其影响早期生命阶段的微生物组定植。
2. 机制揭示：提出Muribaculaceae和Bacteroidaceae作为tet(q)的关键宿主，其HGT能力可能是ARGs扩散的核心机制。
应用价值
- 农业实践优化：需减少未经处理的粪肥直接施用，或通过堆肥发酵降低ARGs活性。
- 公共卫生警示：婴幼儿及农场工作者可能因环境暴露增加肠道耐药风险，需加强监测。