研究报告：基于PCR和DNA探针技术鉴定唾液链球菌（Streptococcus salivarius）及其右旋糖酐酶分布研究

作者及发表信息

本研究由日本昭和大学牙科学院口腔微生物学系的T. Igarashi、A. Yamamoto、N. Goto以及儿科牙科学系的Y. Yano、R. Sasa合作完成，发表于2001年的《Letters in Applied Microbiology》（第32卷，394-397页）。

学术背景

研究领域：本研究属于口腔微生物学与分子生物学交叉领域，聚焦于唾液链球菌（Streptococcus salivarius）的快速鉴定及其右旋糖酐酶（dextranase, Dex）的分布特征。
研究动机：传统鉴定口腔链球菌的方法（如形态学观察、生化测试）耗时长且准确性有限。此前，针对变形链球菌（S. mutans）和表兄链球菌（S. sobrinus）的PCR和DNA探针技术已成功开发，但唾液链球菌的分子检测方法尚未完善。此外，Dex在牙菌斑基质降解中的作用与其致病性相关，但此前仅在两株临床分离株（PC-1和M33）中报道过Dex的存在，其普遍性尚不明确。
研究目标：
1. 开发唾液链球菌特异性的PCR引物和DNA探针；
2. 明确Dex在唾液链球菌口腔分离株中的分布。

实验流程

1. 菌株与DNA提取

• 研究对象：25株参考菌株（涵盖14种口腔链球菌）及130株从12名受试者唾液分离的唾液链球菌。
  
• DNA提取：
  
  • 参考菌株：通过氯化铯-溴化乙锭梯度超速离心法纯化基因组DNA；
    
  • 分离株：采用苯基氯法（benzyl chloride method）提取DNA，确保高通量处理。
    

2. PCR引物与DNA探针设计

• 靶基因：基于唾液链球菌PC-1株的Dex基因序列（GenBank已收录），设计一对特异性引物（SSA442F/SSA2712R）和DNA探针（2271 bp片段）。
  
• 引物序列：
  
  • SSA442F: 5’-AAC GTT GAC CTT ACG CTA GC-3’
    
  • SSA2712R: 5’-GAT TCT GTC AAA GAA GCC AC-3’
    
• 扩增条件：94℃预变性1分钟，随后26个循环（94℃ 1分钟→55℃ 1分钟→72℃ 1分钟），最终72℃延伸5分钟。
  

3. 特异性与灵敏度测试

• 特异性验证：
  
  • PCR和探针仅对唾液链球菌（JCM5707和KT12）产生阳性信号，其他13种链球菌（如S. mutans、S. sobrinus）均为阴性（图1）。
    
• 灵敏度测试：
  
  • PCR可检测低至1 pg的基因组DNA，而探针杂交的检测限为1 ng（图2）。
    

4. 口腔分离株分析

• 样本来源：12名健康受试者的唾液样本，经Mitis-Salivarius琼脂培养和API生化鉴定。
  
• 结果：所有130株分离株均通过PCR和Southern杂交检测到Dex基因（图3），表明Dex在唾液链球菌中广泛存在。
  

主要结果

1. 方法特异性：引物和探针仅靶向唾液链球菌，与其他口腔链球菌无交叉反应。
   
2. 高灵敏度：PCR的检测限（1 pg）优于探针杂交（1 ng），适用于微量样本。
   
3. Dex分布：所有临床分离株均携带Dex基因，提示其在唾液链球菌中普遍存在，可能与其在口腔生态中的功能相关。
   

结论与意义

• 科学价值：
  
  • 首次建立了唾液链球菌的分子鉴定技术，弥补了传统方法的不足；
    
  • 证实Dex基因为该菌种的保守特征，为研究其致病机制提供新靶点。
    
• 应用价值：
  
  • 该方法可快速、准确地检测临床样本中的唾液链球菌，适用于口腔微生物组研究及龋病风险评估。
    

研究亮点

1. 技术创新：首次基于Dex基因设计唾液链球菌特异性分子工具，填补技术空白。
   
2. 发现新颖性：揭示Dex在唾液链球菌中的广泛分布，挑战此前仅限少数菌株的认知。
   
3. 方法通用性：实验流程（如苯基氯法提取DNA）可适配其他口腔细菌的高通量研究。
   

其他有价值内容

• 测序验证：扩增片段经克隆测序确认与已知Dex基因序列一致，确保方法可靠性。
  
• 跨平台兼容性：采用通用试剂（如DIG标记探针）和设备（ABI 373S测序仪），便于实验室推广。
  

（注：专业术语如dextranase首次出现时标注为“右旋糖酐酶（dextranase）”，后续使用中文术语。）