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作者及机构
本研究由Csenge Filep和András Guttman*（通讯作者）合作完成，研究机构包括匈牙利德布勒森大学（University of Debrecen）的Horváth Csaba纪念生物分离科学实验室、匈牙利潘诺尼亚大学（University of Pannonia）的转化糖组学研究组，以及韩国首尔国立大学（Seoul National University）化学系。该研究于2022年9月12日发表在《Analytical Chemistry》期刊上（Anal. Chem. 2022, 94, 13092−13099）。

学术背景
本研究属于分析化学与生物分离科学领域，聚焦于蛋白质电泳分离技术中的电迁移分散（electromigration dispersion, EMD）现象。电迁移分散是毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis, CGE）中影响峰形对称性和分离效率的关键因素之一。研究背景基于以下科学问题：在十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳（SDS-CGE）中，硼酸交联葡聚糖凝胶（borate cross-linked dextran gels）作为筛分介质时，硼酸盐浓度变化如何影响蛋白质亚基（如单克隆抗体轻链和重链）的电迁移行为及峰形不对称性（如前沿峰或拖尾峰）。

研究目标包括：
1. 探究硼酸浓度（340–640 mM）对SDS-CGE中蛋白质峰形的影响；
2. 揭示硼酸盐与凝胶成分（如甘油、葡聚糖）形成的复合物对电迁移分散的作用机制；
3. 提出一种新型“硼酸梯度介导的瞬态迁移率匹配（borate-gradient-mediated transient mobility matching）”方法，以优化多组分蛋白质的分离效率。

研究流程
1. 实验设计
- 研究对象：治疗性单克隆抗体奥马珠单抗（omalizumab）的轻链（light chain, LC, ~25 kDa）和重链（heavy chain, HC, ~50 kDa）亚基，以及10 kDa蛋白质内标（internal standard, IS）。
- 凝胶-缓冲系统：采用不同硼酸浓度（340、440、540、640 mM）的Tris-硼酸-EDTA-甘油（TBEG）缓冲液，分别与2%和10%葡聚糖（2 MDa）凝胶组合。

1. 样品制备

   • 还原性样品处理：奥马珠单抗与β-巯基乙醇和SDS样品缓冲液混合，梯度升温（30–90°C）变性后冷却至室温。
     

2. 电泳分离

   • 仪器：使用Beckman Coulter PA800 Plus系统，50 μm内径熔融石英毛细管（有效长度20 cm），紫外检测波长214 nm。
     
   • 条件：反向极性模式（阴极进样），电场强度500 V/cm，电动力进样（10 kV, 20 s）。
     
   • 创新方法：硼酸梯度电泳——毛细管填充340 mM硼酸凝胶，缓冲池使用1000 mM硼酸凝胶，通过电场驱动梯度形成。
     

3. 数据分析

   • 峰形参数：不对称性（A10%）、分辨率（Rs）、总空间方差（σt²）。
     
   • 迁移率计算：表观迁移率（μapp）和有效迁移率（μeff），结合电渗流（EOF）和粘度数据。
     
   • 理论模型：通过平衡常数（Kb、Kbg、Kbd等）量化硼酸盐-多醇复合物的形成及其对共离子迁移率（μco-ion eff）的影响（公式21）。
     

主要结果
1. 硼酸浓度的影响
- 2%葡聚糖凝胶：随着硼酸浓度升高，轻链和重链均呈现前沿峰（A10% < 1），归因于共离子迁移率降低（μco-ion eff < μprotein eff）及凝胶孔径增大。
- 10%葡聚糖凝胶：轻链从轻微拖尾（340 mM, A10% = 1.04）转为前沿峰（640 mM, A10% = 0.41），重链拖尾减弱（A10%从4.31降至2.06），因高浓度葡聚糖促进硼酸盐-葡聚糖二聚体交联（bd2⁻），降低筛分孔径。

1. 甘油的作用

   • 甘油（0–10%）增加导致pH降低（质子释放），EOF减小，且硼酸盐-甘油复合物（bg⁻）进一步降低共离子迁移率，加剧前沿峰。
     

2. 硼酸梯度电泳

   • 在单次运行中，轻链受毛细管内低硼酸浓度（340 mM）调控，重链受高硼酸梯度（640 mM）优化，峰不对称性分别改善至A10% = 1.04和1.37，分辨率（Rs）稳定在11.21±2.53%。
     

结论与价值
1. 科学意义
- 揭示了硼酸盐在SDS-CGE中的双重角色（共离子与交联剂），提出“共离子迁移率匹配”是减少EMD的核心机制。
- 首次实现“毛细管孔径梯度凝胶电泳”（capillary pore-size-gradient gel electrophoresis），通过硼酸梯度动态调控筛分孔径。

1. 应用价值
   
   • 为单克隆抗体等生物药物的纯度分析和质量控制提供了峰形优化策略。
     
   • 硼酸梯度方法可扩展至其他多组分生物大分子的高效分离。
     

研究亮点
1. 创新方法：硼酸梯度介导的瞬态迁移率匹配技术，解决了传统等度电泳中多组分峰形难以同时优化的难题。
2. 机制解析：通过理论模型量化了硼酸盐-多醇复合物对共离子迁移率的影响，为凝胶电泳缓冲系统设计提供理论依据。
3. 技术拓展：提出的“毛细管孔径梯度电泳”概念为后续开发动态筛分介质开辟了新方向。

其他价值
- 研究数据表明，甘油和葡聚糖浓度需协同优化，以避免pH和EOF对进样效率的干扰（如2%葡聚糖凝胶中EOF变化导致峰高差异）。
- 支持信息中提供了高精度峰拟合的Haarhoff-van der Linde（HVL）函数方法，适用于强不对称峰的分析。