这是一项关于口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）人工糖基化修饰的原始研究。该研究由Zhiyao Li（李志耀）、Hu Dong（董虎）、Shuanghui Yin（尹双辉）等学者共同完成，主要完成单位为中国农业科学院兰州兽医研究所（Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences）的动物疫病防控全国重点实验室（State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention）及甘肃省病原生物学基础学科研究中心（Gansu Province Research Center for Basic Disciplines of Pathogen Biology）。通讯作者为Huichen Guo（郭慧琛）。该论文于2025年发表在期刊 Microbial Biotechnology 上，卷号为18，文章编号为e70271，采用开放获取（open access）模式发表。

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是一种由口蹄疫病毒引起的急性、高度接触性传染病，对许多发展中国家的畜牧业造成严重经济损失。传统的灭活疫苗（inactivated vaccines）虽然有效，但其生产过程中涉及活病毒操作，存在病毒泄漏风险。病毒样颗粒由于形态与天然病毒相似但不含病毒遗传物质，被广泛认为是一种安全的替代疫苗形式。N-糖基化（N-glycosylation）在蛋白质稳定性、抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，APCs）识别及免疫原性调控方面具有重要作用。尽管糖基化改造在包膜病毒（enveloped viruses）中已被广泛采用，但在非包膜病毒（nonenveloped viruses）衣壳蛋白上的工程化糖基化研究仍较为有限。本研究以口蹄疫病毒VLPs为模型，探索通过人工引入N-糖基化位点并在毕赤酵母（*Pichia pastoris*）中表达糖基化VLPs的可行性，旨在评估糖基化对VLPs稳定性、APC摄取效率以及免疫原性的影响，为VLP疫苗的糖基化设计提供参考。

研究的工作流程主要包括以下几个关键步骤。首先，研究团队利用SignalP 5.0和NetNGlyc 1.0等软件预测了VP0、VP3和VP1蛋白的信号肽和潜在N-糖基化位点，发现VP1在100位存在潜在糖基化位点，但该位点位于α-螺旋区域，不易被识别。随后利用Discovery Studio和PyMOL软件进行计算机模拟筛选，从VP1中鉴定出16个可能的人工糖基化位点，最终选择位于表面暴露且处于灵活环区的L51T、P160N和G166T三个氨基酸替换位点进行后续研究。研究构建了多个分泌型表达质粒，首先以VP0为模型筛选信号肽，发现来自*Wickerhamomyces ciferrii*的sp27信号肽介导的分泌效率比α-因子信号肽提高1.3倍。随后构建了含sp27信号肽的VP3和VP1分泌表达质粒以及VP1突变体质粒，并电转化至*Pichia*Pink菌株中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析证实VP3、VP1及糖基化VP1均能被有效分泌表达。糖基化VP1经PNGase F处理后分子量恢复至原始大小，证实了N-糖基化修饰的成功引入。

在VLPs组装方面，未糖基化的野生型（wild-type，WT）VLPs通过胞内共表达VP0、VP3和带His6标签的VP1蛋白进行组装与纯化，而糖基化VLPs则通过将分泌表达的VP0、VP3和糖基化VP1在体外以1:1:1比例混合共组装48小时获得。透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）显示各组均可形成球形颗粒，动态光散射（dynamic light scattering，DLS）结果表明WT VLPs直径约30 nm，而糖基化VLPs直径增至35–40 nm，说明N-聚糖展示在VLPs表面并导致粒径增大。组装效率分析显示WT VLPs约为32%，糖基化VLPs介于30%–35%之间，G166T突变体略有提高。稳定性实验表明，P160N VLPs在25°C下50%解离时间延长超过12小时，而G166T VLPs在25°C下72小时后完整抗原仍保持在约60%，展现出最优的热稳定性。PyMOL分析发现G166T突变形成了“FNYT”N-糖基化基序，该基序可能与其稳定性的提升相关。

为明确糖基化VP1表面展示的N-聚糖种类，研究对G166T VP1进行了LC–MS/MS糖谱分析。共鉴定出18种N-聚糖，其中高甘露糖型（high-mannose type）占72.93%，杂合型（hybrid type）占4.16%，复杂型（complex type）占22.92%。丰度最高的糖型为M9Glc1，相对丰度为41.12%。该结果与毕赤酵母表达系统主要产生高甘露糖型聚糖的特性一致。在树突状细胞（dendritic cells，DCs）摄取实验中，DC2.4细胞分别与WT和糖基化VLPs孵育1、2和6小时，间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay，IFA）结果显示糖基化VLPs在1小时和2小时时被DCs摄取的效率显著高于WT VLPs，其中P160N VLPs在2小时时荧光强度最强。6小时后各组荧光强度趋于一致，提示摄取接近饱和。这表明糖基化修饰能够通过DCs表面的甘露糖受体（mannose receptor，MR）促进VLPs的识别与内化。

小鼠免疫实验进一步评估了糖基化VLPs的免疫原性。54只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为6组，每组9只，分别免疫PBS、*E. coli*来源VLPs（阳性对照）、WT VLPs以及L51T、P160N和G166T VLPs。ELISA结果显示所有VLPs组在免疫后14天即可检测到特异性抗体，并维持至42天。G166T VLPs诱导的中和抗体水平与WT VLPs相当，而P160N VLPs诱导的抗体水平较低。淋巴细胞增殖试验和IFN-γ检测结果显示，G166T VLPs诱导的IFN-γ水平显著升高，糖基化VLPs倾向于诱导更强的Th1型细胞免疫应答。猪体免疫保护试验中，19头FMDV阴性猪随机分为PBS组、E. coli VLPs阳性对照组、酵母来源WT VLPs组和G166T糖基化VLPs组。免疫后28天，各组特异性抗体和中和抗体均显著升高。流式细胞术分析显示G166T组CD4+和CD8+ T淋巴细胞比例分别比WT组高3.48%和7.28%。细胞因子检测显示G166T组IFN-γ和TNF-α水平较WT组略有升高，而IL-1β水平无显著差异，提示未引起炎症因子风暴。攻毒保护试验结果表明，PBS组4头猪全部出现临床症状，G166T糖基化VLPs组5头猪全部获得完全保护，保护率为100%，而WT VLPs组1头猪出现蹄部病变，保护率为80%。

本研究成功在毕赤酵母中制备了带有N-糖基化修饰的口蹄疫病毒VLPs。研究发现，人工引入的糖基化位点不影响VP1的二级结构，糖基化VLPs能够有效组装，且表面展示的N-聚糖以高甘露糖型为主。糖基化修饰显著增强了VLPs的热稳定性、APC摄取效率以及Th1型细胞免疫应答，并在猪体攻毒模型中提供了100%的保护。该研究为非包膜病毒VLPs的糖基化工程提供了新的策略，展示了通过精确设计糖基化序列来开发多糖修饰疫苗的潜力。其方法学价值在于将蛋白质糖基化稳定性增强策略与VLP疫苗免疫原性优化相结合，为研制更安全、更高效的生物工程疫苗提供了参考路径。研究还提示，糖基化位点的选择需兼顾表面暴露程度、结构灵活性以及对抗原表位遮蔽效应的影响，这对未来VLP疫苗的理性设计具有重要指导意义。