关于人类胚胎干细胞体外分化为卵巢卵泡样细胞研究的学术报告
本研究由Kehkooi Kee（清华大学医学院基础医学系，干细胞与再生医学中心）与Martin M. Matzuk（美国贝勒医学院）等人共同主导。其他主要作者包括Dajung Jung, Jie Xiong, Min Ye, Xunsi Qin等。该研究于2017年6月12日发表在Nature Communications期刊上（论文ID：ncomms15680）。
本研究属于生殖生物学与干细胞再生医学交叉领域。理解人类卵子发生（oogenesis）的独特机制，对于揭示不孕症病因、发展生育力保存策略至关重要。尽管利用人类多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）在体外已成功诱导出多种特化细胞类型甚至类器官，但生成功能性的人类卵巢卵泡（ovarian follicle）一直是一个重大挑战。卵巢卵泡是女性生殖的基本功能单位，由处于不同发育阶段的卵母细胞（oocyte）及其周围的支持细胞（如颗粒细胞，granulosa cells）构成。
此前的研究已在从小鼠胚胎干细胞（ESCs）向生殖细胞乃至卵母细胞样细胞分化方面取得进展，但小鼠与人类的生殖细胞发育机制存在显著差异（例如，SOX17基因在人类原始生殖细胞（Primordial Germ Cell, PGC）特化中的关键作用不同于小鼠）。更重要的是，当时最先进的小鼠卵母细胞生成方案仍需依赖来自胎鼠卵巢的体细胞共培养，这在技术层面和伦理层面均限制了其在人类研究中的应用。因此，开发一套不依赖人类胎儿组织、完全在体外实现的、从hPSCs到卵巢卵泡样结构的定向分化系统，具有重要的科学意义和应用前景。
本研究的核心目的是：建立一套稳健的体外分化体系，将人类胚胎干细胞（hESCs）定向分化为卵巢卵泡样细胞（Follicle-Like Cells, FLCs），并利用该系统探究调控人类多能干细胞退出多能性、进入减数分裂以及启动卵泡形成的关键分子机制。
本研究设计了一个多步骤、时序精确的体外分化方案，并结合了分子生物学、细胞生物学、组学分析和移植实验等多种技术进行验证。主要流程如下：
1. 基于人胎卵巢组织的机制探究： * 研究材料： 获取孕12、16、20周的人类胎儿卵巢组织。 * 实验方法： 对组织切片进行免疫荧光染色，检测生殖细胞特异性RNA结合蛋白DAZL、BOULE与多能性标志物OCT4、晚期PGC标志物VASA等的共表达与分布模式。统计不同周龄卵巢中高表达DAZL和OCT4的细胞比例。 * 目的： 在体验证DAZL与多能性退出之间的潜在关联，以及BOULE在减数分裂进程中的可能作用。
2. 调控hESCs退出多能性及进入减数分裂的体外诱导： * 细胞系： 主要使用H9 (女性，XX) hESC系，部分实验使用HSF6系进行验证。 * 分化启动： 将hESCs接种于基质胶上，使用含有BMP4和BMP8a的分化培养基处理1小时，以激活SMAD信号通路，启动分化。 * 关键因子过表达与敲低： 在BMPs短时处理后，立即使用慢病毒载体在hESCs中过表达DAZL 和/或 BOULE，或利用短发夹RNA（shRNA）敲低DAZL。 * 实验分析： * qPCR与Western Blot： 在分化第2至第8天，检测多能性基因（OCT4, NANOG, PRDM14）、DAZL、BOULE及晚期生殖细胞基因（VASA, SYCP3）的mRNA和蛋白水平变化。 * 荧光素酶报告基因实验： 构建包含VASA、SYCP3、CDC25A、CDC25B等基因3‘UTR的报告载体，与野生型或突变型（F84A, R115G）DAZL、BOULE共转染293FT细胞或hESCs，验证这些RNA结合蛋白对其靶基因的转录后调控。 * 流式细胞术DNA含量分析： 在分化第5至第8天，使用Hoechst 33342染色，分析对照组（仅表达荧光蛋白）与实验组（过表达DAZL和BOULE）细胞的DNA含量分布，检测具有4N DNA含量（预示进入减数分裂前期I）的细胞比例。 * 减数分裂涂片与免疫荧光： 制备分化第6至第9天细胞的减数分裂染色体铺片，使用特异性抗体染色检测减数分裂标志物，包括：标志减数分裂重组起始位点的PRDM9、标志DNA双链断裂（DSBs）的γH2AX、联会复合体（synaptonemal complex）核心蛋白SYCP3、以及出现在粗线期（pachytene）重组结上的MLH1。统计阳性细胞核的比例和形态（点状或丝状SYCP3）。
3. 诱导卵泡样结构形成： * 外源性因子处理： 在完成上述DAZL/BOULE诱导（约分化第7天）后，向培养基中添加重组人源GDF9和BMP15（二者以异源二聚体或单独形式添加），持续培养。 * 形态学观察： 使用相差显微镜和体视显微镜定期观察培养物，记录卵泡样细胞团（FLCs） 的出现时间（约第9-13天）、形态（中央为卵母细胞样细胞，外围多层颗粒细胞样细胞）、大小和数量变化。 * 免疫荧光鉴定： 对形成的FLCs进行原位免疫荧光染色，鉴定卵母细胞特异性标志物（透明带蛋白ZP2、转录因子NOBOX）和颗粒细胞标志物（抗穆勒管激素AMH）。
4. FLCs的转录组学分析与功能验证： * RNA测序： 分别提取未分化的hESCs（ES）、自发分化的hESCs（SDE）以及从H9和HSF6细胞系分化获得的FLCs的总RNA，进行全基因组转录组测序（RNA-seq）。进行无监督层次聚类、热图分析、基因本体论（GO）富集分析和主成分分析（PCA），并将FLCs的转录组数据与已发表的人类原始卵母细胞、MII期卵母细胞及颗粒细胞数据进行比较。 * qPCR验证： 独立收集约30个FLCs，通过qPCR验证卵母细胞（SOHLH2, ZP2, NOBOX, H1FOO）和颗粒细胞（CYP19A1, RSPO1）特异性基因的表达。 * 肾包膜移植实验： 将体外生成的FLCs通过“悬滴培养”聚集后，移植到双侧卵巢切除的SCID-beige小鼠的肾包膜下，移植46天后取出移植物。 * 组织学与免疫组化分析： 对移植后的组织进行石蜡包埋、切片、H&E染色以及NOBOX和AMH的免疫荧光染色，观察FLCs在体内环境下的存活情况和结构特征。 * 体外功能检测： 将FLCs在体外成熟培养基中单独培养，收集培养上清液，使用ELISA试剂盒检测雌二醇（estradiol） 的分泌水平。
本研究未涉及全新的自创设备或算法，但其创新之处在于整合并优化了一套时序控制的、结合内源性因子（DAZL/BOULE）过表达和外源性因子（BMPs, GDF9/BMP15）处理的标准化分化流程。 数据分析采用常规的生物信息学流程和统计方法（如Student‘s t-test），确保结果的可靠性。
1. DAZL调控人类生殖细胞退出多能性： 人胎卵巢免疫染色显示，高表达DAZL的细胞几乎不表达OCT4，两者呈互斥模式，且随着胎龄增长（12周到20周），DAZL高表达细胞比例上升，OCT4阳性细胞比例下降，提示DAZL可能与多能性下调有关。体外实验证实，在BMPs诱导后过表达DAZL，能显著下调hESCs中OCT4、NANOG、PRDM14的mRNA和蛋白水平；而敲低DAZL则使这些多能性标志物维持在较高水平。同时，DAZL过表达上调了晚期PGC标志物VASA的蛋白水平。荧光素酶报告实验进一步证明，DAZL能通过VASA和SYCP3的3‘UTR增强其报告基因活性，且此功能依赖于其RNA结合域（突变体F84A和R115G活性丧失）。这明确了DAZL在推动hESCs退出多能态、向晚期PGC发展中的关键转录后调控作用。
2. BOULE通过CDC25A促进减数分裂进程： 在人胎卵巢中，BOULE阳性细胞比例在孕16周的内皮质区达到峰值，其分布与早期减数分裂细胞的位置吻合。机制上，BOULE过表达能特异性上调CDC25A（而非CDC25B）3’UTR报告基因的活性，并在携带CDC25A启动子-EGFP-3‘UTR报告系统的hESCs中增加了EGFP阳性细胞比例。CDC25A是调控减数分裂I进程的关键磷酸酶，此结果提示BOULE可能通过上调CDC25A来促进减数分裂。
3. DAZL与BOULE协同促进hESCs进入减数分裂： 在BMPs启动分化后，同时过表达DAZL和BOULE，能最有效地在hESCs中诱导出减数分裂特征。流式分析显示，诱导组（IG）中具有4N DNA含量的细胞比例显著高于对照组（CG），并在第6天达到峰值（39% vs 19%）。减数分裂涂片分析提供了直接证据：从分化第6天开始，诱导组细胞核中出现PRDM9和γH2AX的共定位（标志减数分裂启动和DSBs形成），第7天出现丝状的SYCP3信号（标志联会复合体形成），第8天可观察到MLH1点状信号与SYCP3共定位（标志进入粗线期及交叉结形成）。这些结果表明，通过协同激活DAZL和BOULE，hESCs在体外能够被诱导进入并推进减数分裂进程。
4. GDF9与BMP15诱导卵巢卵泡样结构形成： 在DAZL/BOULE诱导产生减数分裂生殖细胞的基础上（第7天），添加重组人源GDF9和BMP15，能够在第9-13天诱导出典型的FLCs。这些结构在形态上类似于原始/初级卵泡，中央有一个较大的、类似卵母细胞的细胞，外围环绕着多层扁平的或立方形的细胞。免疫荧光证实，中央细胞表达ZP2（位于细胞外周）和NOBOX（位于核内），外围细胞表达AMH。使用携带VASA-EGFP报告基因的hESC进行分化，EGFP信号特异性出现在FLCs的中央细胞中。这些结果证明，外源性卵泡信号因子能诱导已进入减数分裂的hESC衍生细胞发生卵泡形成（folliculogenesis）。
5. FLCs的分子特征与体内存活能力： RNA-seq分析表明，FLCs的转录组与未分化hESCs及自发分化细胞明显不同，富集于生殖系统发育、生殖过程调控等相关通路。PCA分析显示，FLCs的转录谱更接近人类原始卵母细胞，而非MII期卵母细胞或颗粒细胞。qPCR独立验证了多个卵母细胞和颗粒细胞特异性基因在FLCs中高表达。肾包膜移植实验提供了强有力的功能证据：移植46天后，在移植物中仍能观察到具有典型卵泡样结构（中央为含有生发泡样结构的卵母细胞样细胞，周围为立方体状颗粒细胞样细胞）的FLCs，并且这些结构持续表达NOBOX和AMH。此外，体外培养的FLCs上清中能检测到雌二醇分泌，提示其具有一定的内分泌功能。这些数据综合表明，体外产生的FLCs在分子表型和结构功能上均模拟了体内原始/初级卵泡的特性，并能在异体环境中短期存活。
本研究成功建立了一套全新的、不依赖人类胎儿组织的体外分化体系，能够将人类胚胎干细胞分化为具有卵巢卵泡样结构和分子特征的细胞团。研究揭示了DAZL和BOULE这两个生殖细胞特异性RNA结合蛋白在调控hESCs退出多能性、进入减数分裂过程中的协同核心作用，并证实了GDF9和BMP15在诱导卵泡形成中的必要性。
科学价值： 1. 机制突破： 明确了DAZL和BOULE在人类（而不仅是小鼠）生殖细胞发育，特别是减数分裂启动中的关键功能，为理解人类卵子发生的独特调控网络提供了新见解。 2. 模型建立： 提供了一个强大的体外研究平台，可用于系统性地研究人类多能干细胞向原始生殖细胞、减数分裂生殖细胞乃至卵巢卵泡分化的全过程，便于解析其中独特的分子机制（如长链非编码RNA的作用）。 3. 概念验证： 首次证明hESCs在体外能通过自组织（self-organization）形成类似原始卵泡的复杂结构，扩展了类器官研究在女性生殖系统领域的应用。
应用潜力： 1. 疾病建模与药物筛选： 该体系可用于模拟由减数分裂异常或卵泡发育障碍引起的人类不孕症，为病因研究和药物筛选提供细胞模型。 2. 生育力保护研究： 为将来探索利用患者自体干细胞（如诱导多能干细胞iPSCs）体外生成卵泡样结构，进而用于生育力重建或保护提供了理论基础和技术路线。 3. 毒理学研究： 可用于评估环境毒素或药物对女性生殖细胞发育和卵泡形成的潜在影响。
研究还验证了DAZL基因上两个点突变（R115G，与临床早发性卵巢功能不全相关；F84A，影响RNA结合）对其功能的影响，发现它们均破坏了DAZL对其靶基因的转录后调控能力。这为理解特定基因突变导致的人类生殖障碍提供了直接的分子病理学证据，连接了基础研究与临床表型。此外，研究中对人胎卵巢样本的分析，为理解DAZL和BOULE在人类正常卵子发生过程中的时空表达模式提供了宝贵的在体数据。