血小板来源的凋亡囊泡通过高尔基体磷酸蛋白2（Golph2）-AKT信号轴促进骨再生的研究报告
一、研究概况
本研究由北京大学口腔医学院修复科的Yuhe Jiang、Yuan Zhu、Yuzi Shao等学者完成，通讯作者为Xiao Zhang和Yongsheng Zhou。该论文于2023年11月28日被《ACS Nano》接收并在线发表。
二、研究背景与目的
细胞凋亡是维持机体稳态所必需的程序性细胞死亡过程，在此过程中产生的凋亡囊泡（apoptotic vesicles, apoVs）是一类纳米级异质性细胞外囊泡群，在细胞间通讯中发挥重要作用。已有研究表明，间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）来源的凋亡囊泡在骨代谢中具有促进成骨和抑制破骨细胞形成的功能。然而，MSC来源凋亡囊泡的临床转化面临两大障碍：一是需要大量的细胞培养和扩增，这会导致细胞和囊泡功能的不稳定性；二是核物质可能引发免疫问题。
血小板（platelets, PLTs）作为血液中无核的盘状成分，每天由骨髓巨核细胞产生约1000亿个，具有独特优势：可从全血捐献中大量获取、无核因而避免细胞扩增且降低安全性问题、不含生长培养基成分故减少污染风险。目前关于血小板来源的细胞外囊泡的研究主要集中于微囊泡和外泌体，而血小板在凋亡过程中是否能释放凋亡囊泡尚不确定，其详细特征和生物学特性也未被阐明。因此，本研究旨在探究血小板来源的凋亡囊泡（PLT-derived apoVs）的特性及其在骨再生中的作用。
三、研究流程与方法
本研究包含多个实验环节。首先进行血小板来源凋亡囊泡的分离与表征。研究者从健康志愿者静脉血中分离血小板，利用星形孢菌素（staurosporine, STS）诱导其凋亡，通过梯度离心方案分离凋亡囊泡。经扫描电子显微镜观察血小板形态，确认其符合未活化血小板的典型球形特征；流式细胞术分析显示CD41高表达、CD62P低表达，表明获得了高纯度血小板。研究发现500 nM及以上浓度的STS可在4小时内诱导血小板快速释放凋亡囊泡，每个血小板平均可释放约1860个凋亡囊泡，远高于生理条件下血小板来源细胞外囊泡（platelet-derived extracellular vesicles, PEVs）的267个，且获取时间压缩在6小时内。
其次，对血小板来源凋亡囊泡的特性进行系统鉴定。囊泡呈典型球形形态，具有脂质双层膜，尺寸分布在100-500 nm，膜电位约为-29.84 mV，表面暴露磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS），并富含通用细胞外囊泡标志物TSG101、CD9和CD81。此外，凋亡囊泡继承了亲本细胞的表面标志CD41、CD61和CD62P。
第三，进行蛋白质组学分析。从六名不同志愿者的血液样本中提取蛋白质进行质谱分析，共鉴定出近8200种蛋白质。结果显示99.5%的蛋白质在凋亡囊泡和血小板中重叠，但有520种蛋白质上调、552种下调。KEGG通路分析显示上调蛋白与细胞过程、信号转导、翻译、感染性疾病、脂质代谢、免疫系统和内分泌系统等相关。GO富集分析显示大量蛋白属于膜的整合成分和质膜，分子功能以G蛋白偶联受体活性占比最大。
第四，鉴定特异性生物标志物。依据MISEV2018指南将富集蛋白分为四类，结合蛋白质定量，通过Western blotting和流式细胞术确认了10种候选蛋白在凋亡囊泡中显著富集，包括通用凋亡标志物RhoA、Rab-5a、RPS25、Fas，亲本细胞标志物CD41、CD61、CD62P，以及凋亡囊泡中高表达的非典型趋化因子受体2（atypical chemokine receptor 2, ACKR2）、癫痫相关6样蛋白2（seizure 6-like protein 2, SEZ6L2）和Golph2。免疫电镜进一步验证了CD41、CD61、SEZ6L2和Golph2在囊泡膜上的定位，确定了六种特异性生物标志物。
第五，验证生物学功能。体外实验发现，100 ng/ml的血小板来源凋亡囊泡对MSCs无毒性，可促进碱性磷酸酶活性和矿化结节形成，上调成骨基因和蛋白表达。体内异位成骨实验中，载有经凋亡囊泡预处理的MSCs的β-磷酸三钙支架可在裸鼠体内形成骨样组织。在卵巢切除骨质疏松小鼠模型中，尾静脉注射凋亡囊泡可显著改善骨量、增加骨密度和骨小梁数量，并恢复内源性MSCs的成骨分化能力。在大鼠颅骨临界尺寸缺损模型中，装载于聚乳酸-羟基乙酸共聚物/聚多巴胺支架的凋亡囊泡可诱导显著的板层骨形成。
第六，阐明分子机制。蛋白质组学分析发现，经凋亡囊泡诱导后MSCs中Golph2的蛋白表达变化倍数高达139.4。通过构建Golph2敲低的MSCs，证实Golph2是成骨分化的正向调节因子，且凋亡囊泡可通过恢复Golph2蛋白水平和激活AKT信号通路挽救因Golph2缺乏而导致的成骨分化下调。RT-qPCR结果显示Golph2基因表达稳定，表明受体细胞可能直接利用凋亡囊泡中的Golph2蛋白。免疫荧光观察证实了Golph2蛋白从凋亡囊泡到MSCs的递送。利用AKT变构抑制剂MK-2206阻断AKT磷酸化后，凋亡囊泡的促成骨效应几乎被消除。免疫共沉淀实验证实外源性Golph2与AKT相互作用并调节其磷酸化。在动物模型中，Golph2缺失或AKT信号抑制均使凋亡囊泡丧失治疗骨疏松和促进骨愈合的能力。
四、主要研究结果
本研究首次全面确定了血小板来源凋亡囊泡的特性。血小板在STS诱导下凋亡时间远短于有核细胞，且释放大量凋亡囊泡，产量远高于传统PEVs。凋亡囊泡既符合通用凋亡囊泡特性，又继承亲本血小板标志物。
蛋白质组学图谱鉴定出六种特异性富集蛋白作为生物标志物，其中ACKR2、SEZ6L2和Golph2等蛋白的差异表达倍数高达7.84至8.43。功能性蛋白与多种细胞行为密切相关。
在功能层面，血小板来源凋亡囊泡在体外和体内均可促进MSCs成骨分化，有效缓解雌激素缺乏引起的骨丢失，并促进临界尺寸颅骨缺损的骨愈合。值得注意的是，来自1毫升人全血的血小板来源凋亡囊泡足以修复直径5毫米的异种缺损，且其有效浓度仅为MSC来源凋亡囊泡的一半。
在机制层面，研究揭示了此前未被认识的血小板来源凋亡囊泡与MSC相互作用机制：凋亡囊泡递送Golph2蛋白至受体MSCs，Golph2与AKT相互作用并诱导其磷酸化，从而调控MSCs成骨分化。该机制在骨质疏松和骨缺损动物模型中均得到验证。
五、研究意义与价值
本研究具有重要的科学价值和应用前景。在科学层面，首次全面阐明了血小板来源凋亡囊泡的特征、蛋白质组学图谱和特异性生物标志物，填补了血小板凋亡领域的研究空白。揭示的Golph2-AKT信号轴为理解凋亡囊泡与MSCs的相互作用提供了新认知。在应用层面，血小板来源凋亡囊泡有望成为骨再生领域的无细胞治疗药物。相比MSC来源凋亡囊泡，其优势包括：无需细胞培养扩增、无核物质免疫风险、来源丰富且获取简便、产量高且提取快速。自体血小板来源凋亡囊泡还可避免免疫排斥和伦理问题，为无细胞的骨组织工程提供了有前景的新策略。
六、研究亮点
本研究的主要亮点包括：第一，首次证实血小板在凋亡过程中可释放大量凋亡囊泡，并系统阐明了其特性；第二，建立了血小板来源凋亡囊泡的精准蛋白质图谱，鉴定出六种特异性生物标志物；第三，发现Golph2作为凋亡囊泡货物蛋白可直接递送至受体细胞，通过激活AKT信号通路促进骨再生，揭示了此前未被认识的凋亡囊泡与MSC互作机制；第四，证明了血小板来源凋亡囊泡在多种骨病模型中的治疗潜力，为临床转化奠定了基础。