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α-酮戊二酸通过激活AMPK-PGC-1α/NRF2通路防止高脂血症引起的脂肪肝线粒体功能障碍和氧化应激

期刊:氧化还原生物学DOI:10.1016/j.redox.2024.103230

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作者与机构
本研究由邓宇、张墨、郑烨子、王敏、高艺琳、王旭东、刘旭云、吕伟强、曾鑫、康斯坦丁·N·贝洛斯鲁杰夫、苏家灿、赵琳、刘建康等多位作者共同完成。研究团队来自多个机构,包括中国西安交通大学第一附属医院心内科与皮肤科、生物医学信息工程教育部重点实验室、生命科学与技术学院、线粒体生物学与医学中心、心血管代谢创新中心,以及俄罗斯玛里国家大学和俄罗斯科学院理论与实验生物物理研究所等。该研究于2024年6月13日在线发表在《氧化还原生物学》(Redox Biology)期刊上,文章编号为103230。

学术背景
高脂血症是一种以血脂水平异常升高为特征的代谢性疾病,常与非酒精性脂肪肝病(NAFLD)等慢性疾病相关。尽管α-酮戊二酸(α-ketoglutarate, AKG)作为三羧酸循环(TCA循环)的重要中间体,已被证明对高脂血症引起的血脂异常和内皮损伤具有保护作用,但其对高脂血症引起的肝脏脂质代谢紊乱的具体机制尚未充分研究。本研究旨在探讨AKG对高脂血症诱导的脂肪肝的保护作用及其分子机制,特别是通过激活AMPK-PGC-1α/NRF2通路来调节线粒体功能和氧化还原稳态。

研究流程
本研究分为多个实验步骤,涵盖了体内和体外实验,具体流程如下:

  1. 动物实验
    使用8周龄的雄性C57BL/6J小鼠,随机分为四组:对照组、AKG组、P407组和P407+AKG组。AKG组和P407+AKG组的小鼠每天灌胃50 mg/kg的AKG,持续9天;第10天,P407组和P407+AKG组的小鼠腹腔注射P407(0.5 g/kg)以诱导高脂血症,持续24小时。对照组和AKG组注射等量的生理盐水。实验结束后,采集血液和肝脏组织进行生化分析和组织学检测。

  2. 细胞实验
    使用HepG2细胞和原代肝细胞进行体外实验。HepG2细胞和原代肝细胞分别用不同浓度的AKG预处理,然后用棕榈酸(PA)处理以模拟脂质过载。通过MTT实验检测细胞活力,通过线粒体膜电位(MMP)和线粒体DNA(mtDNA)拷贝数评估线粒体功能,同时检测细胞内脂质积累和氧化应激水平。

  3. 生化分析
    对小鼠肝脏和血清中的甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-cho)、游离脂肪酸(FFA)、ATP含量、脂质过氧化物(LPO)、丙二醛(MDA)、蛋白质羰基等指标进行检测。同时,测定抗氧化酶如过氧化氢酶(Catalase)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

  4. 分子机制研究
    通过Western blot分析AMPK、PGC-1α、NRF2、线粒体复合物亚单位(如NDUFS3、SDHB、MTCO1、ATP5A)等蛋白的表达水平。通过免疫沉淀实验检测NRF2的泛素化水平,并研究AKG对NRF2核转位的影响。

  5. 线粒体功能评估
    通过线粒体追踪红染色观察线粒体形态,通过实时PCR检测mtDNA拷贝数,并通过线粒体复合物活性测定评估线粒体呼吸链的功能。

  6. siRNA实验
    使用siRNA敲低PGC-1α和NRF2的表达,研究其在AKG保护作用中的具体机制。

主要结果
1. AKG减轻肝脏脂质代谢紊乱
在P407诱导的高脂血症小鼠模型中,AKG预处理显著降低了血清和肝脏中的TG、T-cho和FFA水平,同时改善了肝脏脂肪变性和肝功能酶(AST和ALT)的升高。

  1. AKG改善线粒体功能障碍
    AKG预处理显著恢复了P407诱导的ATP含量和mtDNA拷贝数的下降,并保护了线粒体复合物I、II、III和V的蛋白表达和活性。此外,AKG还恢复了PGC-1α及其下游蛋白(如TFAM、MFN1、MFN2)的表达。

  2. AKG抑制氧化应激
    AKG预处理显著降低了肝脏中的ROS、LPO、MDA和蛋白质羰基水平,同时提高了抗氧化酶(如Catalase和SOD2)的活性。此外,AKG还抑制了SOD2的乙酰化,增强了其活性。

  3. AKG通过AMPK-PGC-1α/NRF2通路发挥作用
    AKG预处理显著激活了AMPK的磷酸化,并促进了PGC-1α和NRF2的表达。siRNA实验表明,敲低PGC-1α或NRF2显著削弱了AKG对脂质过载和氧化应激的保护作用。

结论
本研究表明,AKG通过激活AMPK-PGC-1α/NRF2通路,显著改善了高脂血症引起的肝脏脂质代谢紊乱、线粒体功能障碍和氧化应激。作为一种内源性线粒体营养物质,AKG在预防和治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)方面具有潜在的应用价值。

研究亮点
1. 首次揭示了AKG通过AMPK-PGC-1α/NRF2通路对高脂血症诱导的脂肪肝的保护作用。
2. 通过体内和体外实验全面验证了AKG对肝脏脂质代谢、线粒体功能和氧化应激的调节作用。
3. 发现AKG通过抑制NRF2的泛素化和促进其核转位来增强抗氧化能力,这一机制具有创新性。

其他价值
本研究为开发基于AKG的代谢性疾病治疗策略提供了重要的理论依据,并为深入研究线粒体功能与代谢紊乱的关系开辟了新的方向。


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