本文发表于 *ACS Pharmacology & Translational Science*，于2018年7月26日出版。研究由Monash University药物科学研究所的Yi-Lynn Liang、Peishen Zhao、Christopher Draper-Joyce、Denise Wootten、Patrick M. Sexton、Sebastian G. B. Furness等人完成，其中Denise Wootten、Patrick M. Sexton与Sebastian G. B. Furness为通讯作者，复旦大学药学院为合作单位。
该研究属于G蛋白偶联受体（GPCR）结构生物学领域。GPCR是重要的药物靶点，解析其与下游信号蛋白复合物的高分辨率结构对理解药物作用机制和理性药物设计至关重要。然而，完全激活态的GPCR与异源三聚体G蛋白形成的复合物本身不稳定。在生理条件下，激动剂结合的GPCR作为鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）促进Gα亚基释放GDP并随后结合GTP，导致G蛋白异源三聚体解离并激活下游信号通路。这种内在不稳定性使得在结构研究中很难捕获并纯化稳定的激动剂–GPCR–G蛋白三元复合物。此前已报道的少数活性态GPCR–G蛋白复合物结构多依赖纳米抗体Nb35来稳定Gα–Gβγ界面，或使用高度工程化的mini-G蛋白，但这些方法适用范围有限。因此，本研究旨在通过工程化改造Gα亚基，降低其核苷酸亲和力，抑制Gα与Gβγ的解离，从而稳定并纯化激动剂–GPCR–G蛋白复合物，为冷冻电镜（cryo-EM）结构解析提供通用工具。
研究的工作流程分为几个核心步骤。首先是设计并构建显性负性（dominant negative, DN）Gα蛋白。作者基于已知的G蛋白结构与突变功能研究，选择在Gαs和Gαi2中引入保守位点突变。具体而言，DN-Gαs包含S54N、G226A、E268A、N271K、K274D、R280K、T284D、I285T和A366S九个突变；DN-Gαi2包含S47N、G204A、E246A和A327S四个突变。其中S（H1.02）N突变影响Mg²⁺配位及与GTP β-磷酸的接触，G（S3H2.02）A突变阻断GTP诱导的G蛋白解离，E（H3.04）A突变破坏保守盐桥，A（S6H5.03）S突变提高GDP解离速率。Gαs中的额外五个突变来自将Gαi2的α3螺旋及α3螺旋–β5链连接区的残基替换入Gαs，以增强显性负性效应。
其次是蛋白表达与复合物纯化。研究使用杆状病毒在昆虫细胞中表达人源受体、Gα亚基、His标签的Gβ1和Gγ2亚基。对于CTR、GLP-1R和CLR:RAMP1，受体与异源三聚体G蛋白共表达；A1-AR则与Gi蛋白分别表达后混合。复合物形成在加入激动剂和apyrase的条件下进行，以促进GDP水解并稳定核苷酸缺失态。膜组分经LMNG和CHS去污剂溶解后，通过M1抗FLAG亲和树脂和/或Ni-NTA树脂纯化，再利用分子筛层析（SEC）分离完整复合物。整个流程中，部分实验加入Nb35以进一步提高复合物稳定性。该方法的关键创新在于利用DN-Gα蛋白替代野生型（WT）Gα，使原本难以纯化或产量极低的复合物得以稳定并以均一状态获得。
第三是复合物质量评估与结构解析。对纯化后的复合物进行SDS-PAGE、Western blot和SEC分析以评估成分和均一性。利用负染电子显微镜（negative stain EM）观察颗粒形态并进行二维（2D）分类平均，以判断复合物是否足够稳定和均一用于冷冻电镜数据收集。最后对符合条件的复合物进行单颗粒冷冻电镜成像与三维（3D）重建，获得高分辨率结构。
研究的主要结果包括：在GLP-1R体系中，使用激动剂exendin-P5时，WT-Gαs复合物无法纯化至均一；而使用DN-Gαs后，GLP-1R和CTR复合物均可纯化至均一，产量约200 μg/L，负染EM显示约28%的完整复合物颗粒。加入Nb35后，WT和DN-Gαs复合物产量和化学计量比相似，但DN复合物纯度和均一性更好，最终解析出3.3 Å的GLP-1R–Gs复合物结构。在低效能激动剂oxyntomodulin体系中，初始1 μM激动剂条件下WT和DN-Gs复合物形成均较弱，但DN-Gs产量更高；将激动剂浓度提高至50 μM后，DN-Gs复合物产量显著改善，可以纯化至均一，负染EM显示大量完整复合物2D类别。这些结果证明DN-Gαs在低效能激动剂或不稳定复合物体系中具有明显优势。
在CGRP受体体系中，使用WT-Gαs和Nb35虽然有少量复合物形成，但产量极低（<25 μg/L），无法进行SEC分析。改用DN-Gαs后，复合物产量提高至约200 μg/L，SEC呈现单分散峰，负染EM显示均一稳定颗粒，最终解析出3.3 Å的全活性态CGRP受体结构。该结果进一步证明DN-Gαs可用于多组分、异源二聚体GPCR复合物的结构解析。
在A1-AR体系中，研究者测试了DN-Gαi2对非Gs类G蛋白偶联受体的适用性。使用WT-Gαi2时，腺苷–A1-AR–Gi2复合物可被纯化，产量约150 μg/L，但SEC呈现宽峰，表明复合物亲和力低、交换动力学快；收集的SEC组分中G蛋白相对于受体为亚化学计量。使用DN-Gαi2后，SEC呈现单分散峰，Western blot显示受体与G蛋白的各组分接近等化学计量，产量略提高至200 μg/L。负染EM和2D分类平均显示颗粒均一稳定，最终解析出3.6 Å的A1-AR–Gi2复合物结构。此外，使用DN-Gαi3也能形成稳定复合物，SEC为单分散峰，负染EM颗粒行为良好，提示该方法可扩展至Gi/o家族其他成员。
为验证DN-Gα蛋白的构象功能是否与野生型一致，研究者使用生物发光共振能量转移（BRET）实验检测激动剂诱导的G蛋白构象变化。结果显示，在CTR和GLP-1R激活下，WT与DN-Gαs的激动剂诱导构象变化速率和幅度无显著差异；但加入GTP后，DN-Gαs对GTP诱导的构象变化敏感性降低，DN-Gαi2则完全抵抗GTP诱导的构象变化。这证明DN突变确实降低了G蛋白对GTP的敏感性，但并未改变激动剂诱导的受体–G蛋白变构偶联特性。
本研究的结论是：在Gαi和Gαs亚基中引入保守位点突变构建的显性负性G蛋白可以有效稳定激动剂–GPCR–G蛋白三元复合物。这些突变降低了G蛋白的核苷酸亲和力，限制了Gα与Gβγ的解离，但不改变受体激活时的构象重排。DN-Gα蛋白为激动剂–GPCR–G蛋白复合物的高分辨率冷冻电镜结构解析提供了高价值工具，特别适用于不稳定或低效能激动剂体系，对转化药物发现具有重要意义。
本研究的亮点包括：首次系统验证了显性负性G蛋白在多种GPCR体系（GLP-1R、CTR、CGRP受体、A1-AR）中的广适性；成功解析了此前难以获得的全活性态A1-AR–Gi复合物和CGRP受体–Gs复合物；通过BRET实验证明DN-Gα蛋白保持与野生型相似的变构功能，从而保证了结构解析结果具有生理相关性。此外，研究详细展示了不同受体和G蛋白组合的纯化策略，为后续研究提供了可操作的实验流程和关键参数。