骨骼来源的PDGF-BB升高通过诱导周细胞PDGFRβ脱落损害海马血管系统

主要作者与研究机构：该研究由Guanqiao Liu、Jiekang Wang、Zhiliang Wei、Ching-Lien Fang、Ke Shen、Cheng Qian、Cheng Qi、Tong Li、Peisong Gao、Philip C. Wong、Hanzhang Lu、Xu Cao及Mei Wan等人完成。研究团队主要来自Johns Hopkins University School of Medicine的骨科、放射科、病理科及神经科学系。该论文发表于Advanced Science期刊，2023年在线发表（DOI: 10.1002/advs.202206938）。

学术背景：骨骼衰老与脑血管疾病及脑老化之间存在独特关联，但骨-脑相互作用的机制长期不明。血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）由微血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞共同构成，其中周细胞对维持BBB完整性至关重要。血小板衍生生长因子BB（platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB）及其受体PDGF受体β（PDGF receptor β, PDGFRβ）介导的周细胞-内皮细胞串扰在脑微血管周细胞覆盖和BBB稳态维持中发挥关键作用。此前研究表明，破骨前体细胞（preosteoclasts）分泌PDGF-BB，且骨骼来源的PDGF-BB在衰老和代谢应激下显著升高。然而，循环PDGF-BB升高如何影响脑血管系统尚不清楚。本研究旨在利用条件性基因敲除和转基因小鼠模型，阐明骨源性PDGF-BB在海马BBB损伤中的作用及其分子机制。

研究流程：研究分为多个递进的实验步骤。首先，研究者检测了不同月龄（3、6、9、22个月）C57BL/6小鼠血清和血浆中PDGF-BB浓度，并通过免疫荧光染色分析海马齿状回（dentate gyrus, DG）和CA1区毛细血管密度（CD31标记）及周细胞覆盖（CD13标记），同时用不同分子量右旋糖酐、Evans蓝和白蛋白外渗实验评估BBB通透性。其次，利用破骨前体细胞特异性PDGF-BB转基因小鼠（pdgfbctg）和野生型同窝对照，在不同月龄检测血清/血浆PDGF-BB水平、海马毛细血管长度与面积、周细胞覆盖，并通过WEPCAST MRI无创测量BBB水分子保留分数（water retaining fraction, WRF）、脑体积、右旋糖酐渗漏、Evans蓝和白蛋白外渗，以及非特异性转胞吞标志物caveolin-1、碱性磷酸酶（alpl）和受体介导转胞吞受体Tfrc的表达变化；同时进行Y迷宫自发交替、空间识别和新物体识别等行为学测试评估认知功能。第三，利用条件性PDGF-BB敲除小鼠（pdgfbcko）在衰老和高脂饮食（high-fat diet, HFD）模型中验证循环PDGF-BB正常化是否能改善海马微血管损伤和认知下降。第四，在体外用重组人PDGF-BB（rh-PDGFBB）处理原代人脑周细胞不同时间（8、24、72小时）和不同浓度（10、50 ng/mL），通过Western blot检测PDGFRβ表达、免疫沉淀检测培养液中可溶性PDGFRβ（soluble PDGFRβ, sPDGFRβ），流式细胞术检测受体胞吞比例，并用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂氯喹排除蛋白降解途径。第五，通过细胞外基质与黏附分子PCR芯片筛选PDGF-BB刺激后上调的基因，发现MMP14上调最显著（约25倍），用qPCR和Western blot验证，并用siRNA敲低MMP14或使用MMP抑制剂GM6001处理细胞和小鼠，检测PDGFRβ脱落、周细胞丢失和BBB渗漏的改善情况。

主要结果：衰老小鼠血清PDGF-BB在9月龄开始升高，22月龄时较3月龄升高近3倍；血浆PDGF-BB升高更显著，约9.4倍，提示升高主要来源于非血小板来源。海马区PDGF-BB浓度在衰老小鼠中特异性升高，而皮层和丘脑无明显变化。海马DG和CA1区毛细血管密度和周细胞覆盖在衰老小鼠中显著降低，且与血清PDGF-BB升高呈强相关。10 kDa右旋糖酐渗漏、Evans蓝和白蛋白外渗在衰老小鼠海马中显著增加，表明BBB对小分子的通透性升高。HFD小鼠也表现出类似的血清/血浆PDGF-BB升高和海马血管损伤。pdgfbctg小鼠从1.5月龄起血清和血浆PDGF-BB升高，6和9月龄时海马毛细血管长度和面积减少，周细胞丢失更显著，且与PDGF-BB水平强相关；WEPCAST MRI显示pdgfbctg小鼠脑静脉水分子保留分数降低，提示BBB渗漏；非特异性转胞吞标志物caveolin-1和alpl上调，Tfrc下调，与衰老脑BBB表型一致；认知行为测试显示6月龄pdgfbctg小鼠出现工作记忆和识别记忆缺陷。pdgfbcko小鼠在衰老和HFD条件下循环PDGF-BB被正常化，海马毛细血管丢失、周细胞丢失、白蛋白外渗以及认知下降均得到显著缓解。体外实验中，低浓度（10 ng/mL）短时间（24小时）PDGF-BB处理引起PDGFRβ胞吞，但长期（72小时）高浓度（20–50 ng/mL）处理导致PDGFRβ表达几乎消失，同时培养液中sPDGFRβ显著增加，且不依赖蛋白酶体或溶酶体降解途径。衰老小鼠脑脊液中sPDGFRβ显著升高。PCR芯片和后续验证确认MMP14在PDGF-BB刺激的周细胞中显著上调，免疫荧光显示MMP14与PDGFRβ共定位；衰老小鼠和pdgfbctg小鼠海马中MMP14表达增加而PDGFRβ减少；GM6001处理或MMP14 siRNA敲低可阻断PDGF-BB诱导的PDGFRβ脱落和sPDGFRβ释放。体内实验中，GM6001短期处理pdgfbctg小鼠可恢复海马PDGFRβ表达并挽救周细胞丢失，长期处理衰老小鼠可减轻海马BBB渗漏。

结论与意义：该研究确立了骨源性PDGF-BB在介导海马BBB破坏中的因果作用，并揭示了配体诱导的PDGFRβ脱落是年龄相关PDGFRβ下调及周细胞丢失的反馈机制。研究提出PDGF-BB水平需维持精细平衡：过低或过高均损害脑血管系统。该发现为骨-脑轴提供了新的分子基础，并提示血循环PDGF-BB和脑脊液sPDGFRβ可能作为BBB损伤和周细胞退变的潜在生物标志物，MMP抑制剂可能具有治疗脑血管衰老相关疾病的应用前景。

研究亮点：首次证明衰老过程中骨骼破骨前体细胞来源的PDGF-BB升高足以驱动海马周细胞丢失和BBB损伤及认知下降；发现PDGF-BB长期高浓度暴露可通过上调MMP14引起其自身受体PDGFRβ胞外域脱落，形成负反馈机制；利用WEPCAST MRI无创检测BBB水通透性变化；结合条件性转基因、基因敲除、体外原代周细胞实验和多种BBB功能检测手段形成完整的因果证据链。此外，研究提示海马对循环PDGF-BB升高具有区域特异性易感性，而皮层和其他脑区在pdgfbctg小鼠中未表现出显著血管损伤，这可能与周细胞表型异质性或衰老过程中BBB通透性增加的区域时序有关。