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人类发育造血过程的单细胞RNA-seq与ATAC-seq整合分析

作者与机构
本研究由Anna Maria Ranzoni（剑桥大学血液学系、Wellcome Trust-MRC剑桥干细胞研究所、Wellcome Trust Sanger研究所）领衔，联合Andrea Tangherloni、Ivan Berest等共9位作者合作完成，通讯作者为Ana Cvejic（as889@cam.ac.uk）。研究成果于2021年3月4日发表于《Cell Stem Cell》（卷28，页472-487），DOI: 10.1016/j.stem.2020.11.015。

学术背景
研究领域为发育血液学，聚焦人类胎儿造血干细胞（HSCs）的分化机制。尽管小鼠模型和体外研究已揭示了胎儿造血的动态特征，但人类发育过程中造血干/祖细胞（HSPCs）的表观遗传和转录调控仍不明确。此前研究多依赖表面标记（如CD分子）分离细胞群体，但近年单细胞技术显示这些标记无法准确反映细胞状态异质性。本研究旨在通过整合单细胞转录组（scRNA-seq）和染色质可及性（scATAC-seq）分析，绘制人类胎儿肝脏和骨髓HSPCs的高分辨率图谱，揭示其分化轨迹和表观遗传调控机制。

研究流程与方法
1. 样本收集与单细胞分选
- 研究对象：17-22孕周（PCW）的人类胎儿肝脏、股骨和髋骨骨髓，共15例个体。
- 分选策略：采用流式细胞术（FACS）分选免疫表型定义的造血细胞群体，包括非定向祖细胞（Lin⁻CD34⁺CD38⁻）、定向祖细胞（Lin⁻CD34⁺CD38⁺）及成熟血细胞（如红细胞、巨核细胞等）。分选后分别进行scRNA-seq（Smart-seq2协议）和scATAC-seq（转座酶可及性染色质测序）。

1. 单细胞测序与数据生成

   • scRNA-seq：对4,504个细胞进行测序，平均每个细胞检测3,600个基因，覆盖约67万条reads。通过自编码器（autoencoder）和BBKNN算法校正批次效应，使用Leiden聚类识别23个转录群体。
     
   • scATAC-seq：对3,611个CD34⁺CD38⁻细胞核进行测序，平均每个细胞检测32,400个片段，56%比对至开放染色质区域。采用迭代峰值调用（iterative peak-calling）和Harmony算法整合数据，识别7个染色质可及性簇。
     

2. 数据分析与整合

   • 分化轨迹推断：基于ForceAtlas2和PAGA算法构建造血分化路径，结合伪时间分析（diffusion pseudotime）明确HSCs到下游祖细胞的过渡。
     
   • 表观-转录组关联：使用锚点匹配（anchors）方法将scATAC-seq细胞映射至scRNA-seq定义的群体，分析染色质可及性与基因表达的时序关系。
     
   • 调控网络预测：通过pySCENIC分析转录因子（TFs）调控网络，识别关键调控因子（如GATA1、HLF）。
     

3. 功能验证

   • 新分选策略设计：基于scRNA-seq标记基因（CD52、CD62L、CD133），优化HSCs/多能祖细胞（MPPs）的分选方案（Lin⁻CD34⁺CD38⁻CD52⁺CD62L⁺CD133⁺，简称CD-ref），富集效率达88%。
     
   • 体外分化实验：将CD-ref细胞接种于小鼠MS5或人胎儿间充质干细胞（fMSCs）培养体系，评估其多系分化潜能（红系、髓系、巨核系、淋巴系）。
     

主要结果
1. 造血分化轨迹的解析
- 三群寡能祖细胞：发现HSCs/MPPs下游存在三类高增殖性祖细胞：
- MEMP（巨核-红系-肥大细胞祖细胞）：表达GATA1、KLF1，分化为红细胞、巨核细胞和肥大细胞。
- LMP（淋巴-髓系祖细胞）：表达IGLL1、CD79B，分化为B细胞、单核细胞和树突状细胞。
- GP（粒细胞祖细胞）：表达AZU1、MPO，定向分化为粒细胞。
- 表观遗传早于转录变化：HSCs/MPPs在染色质水平（如GATA1基序可及性）已出现谱系倾向性，但转录水平未显示明显“ priming（预激活）”。

1. HSCs/MPPs的异质性

   • 器官特异性差异：骨髓来源的HSCs/MPPs比肝脏来源的更静止（70% vs. 52%处于G1期），且下调细胞迁移相关基因（如JAML、SELPLG）。
     

2. 分选策略优化

   • CD-ref的验证：单细胞培养显示，CD-ref细胞可形成多系集落（7%四系、43%三系），证实其干细胞特性。
     

结论与意义
1. 科学价值：首次整合单细胞多组学揭示人类胎儿造血的表观-转录调控时序，提出“染色质 priming 先于转录激活”的新观点，挑战了传统“造血树”模型的线性分化假设。
2. 应用价值：优化的CD-ref分选方案为血液疾病研究和再生医学提供了高纯度HSCs/MPPs来源。

研究亮点
1. 技术创新：结合scRNA-seq与scATAC-seq，开发迭代峰值调用和跨模态数据整合方法。
2. 发现创新：鉴定MEMP等新型祖细胞群体，揭示表观遗传在命运决定中的先驱作用。
3. 临床潜力：CD-ref策略显著提升HSCs/MPPs富集效率，助力移植医学。

其他价值
研究数据通过开源平台共享，为后续探索血液病理（如白血病起源）提供了重要资源。