这篇文档属于类型a，是一篇关于组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）及其变体Tenecteplase（TNK-tPA）通过细胞内在补体系统影响血脑屏障（BBB）通透性的原创性研究。以下是针对该研究的学术报告：

作者与发表信息

本研究由Charithani B. Keragala（第一作者）和Robert L. Medcalf（通讯作者）领衔的团队完成，团队成员来自澳大利亚莫纳什大学（Monash University）的分子神经创伤与止血实验室、昆士兰大学生物医学科学学院等机构。研究于2020年12月8日发表在Frontiers in Neurology期刊（Volume 11, Article 577272），标题为《Tissue-Type Plasminogen Activator and Tenecteplase-Mediated Increase in Blood Brain Barrier Permeability Involves Cell Intrinsic Complement》。

学术背景

研究领域与动机

研究聚焦于急性缺血性卒中（AIS）的治疗机制，核心科学问题围绕t-PA溶栓治疗的副作用——血脑屏障破坏及脑出血风险。t-PA虽为AIS一线药物，但约6.8%的患者会出现症状性脑出血，且其溶栓成功率仅40%。此外，t-PA可通过纤溶酶非依赖性途径（如补体激活）加剧BBB通透性，但具体机制尚不明确。

关键背景知识

1. 补体系统：传统认为补体（如C3a、C5a）通过免疫反应影响BBB，但近年发现细胞内在补体（“complosome”）可能直接调控内皮细胞和星形胶质细胞功能。
   
2. t-PA与TNK-tPA：TNK-tPA是t-PA的变体，半衰期更长（30分钟 vs. 5分钟），但其对BBB和补体系统的影响缺乏系统研究。
   

研究目标

验证C5a-C5aR1信号通路在t-PA/TNK-tPA介导的BBB通透性增加中的作用，并评估C5aR1抑制剂（如PMX205）的治疗潜力。

研究流程与方法

1. 体外BBB模型构建

• 研究对象：人脑微血管内皮细胞（BECs）与人SVG星形胶质细胞共培养于Transwell多孔膜两侧，模拟BBB结构（图1A）。
  
• 实验分组：
  
  • 刺激组：在管腔侧（内皮细胞）加入t-PA（25 nM）或TNK-tPA（25/50 nM）及纤溶酶原（Plg, 100 nM）。
    
  • 抑制剂组：联合使用PMX205（非竞争性C5aR1拮抗剂）、Avacopan（竞争性C5aR1拮抗剂）或Eculizumab（C5单抗）。
    
• 检测指标：通过FITC-BSA荧光示踪法评估5小时和24小时的BBB通透性变化。
  

2. 单细胞模型验证

• 单独培养BECs或星形胶质细胞，明确两种细胞对t-PA/Plg的敏感性及PMX205的抑制作用（图1B）。
  

3. 补体组分定位分析

• 免疫荧光染色：检测C5和C5aR1在BECs和星形胶质细胞中的表达分布（图5）。
  
• 阳性对照：THP-1单核细胞（高表达补体成分）。
  

4. 功能验证实验

• 延时给药实验：PMX205在t-PA/Plg刺激后1–3小时加入，评估其保护作用（图6）。
  
• 纤溶酶活性检测：通过S-2251显色底物法排除抑制剂对纤溶酶的直接干扰（图4）。
  

数据统计

• 采用GraphPad Prism 8.0进行单因素ANOVA与Dunnett多重比较检验，显著性阈值p < 0.05。
  

主要结果

1. PMX205显著抑制t-PA介导的BBB通透性增加

   • 5小时和24小时的通透性分别降低80%和34%（p < 0.0001），且呈剂量依赖性（10–100 μM）（图2A–C）。
     
   • 机制：PMX205阻断t-PA诱导的细胞骨架重构（图2D），而Avacopan和Eculizumab无效，提示C5aR1非经典信号通路（如细胞内补体）的参与。
     

2. BECs是PMX205作用的主要靶点

   • 单细胞模型中，PMX205仅显著抑制BECs的通透性（降低66%，p < 0.005），星形胶质细胞无响应（图3A–B）。
     

3. 细胞内补体组分的表达

   • C5和C5aR1均定位于BECs和星形胶质细胞的胞质及细胞膜（图5），支持“complosome”假说。
     

4. TNK-tPA的类似效应可被PMX205抑制

   • TNK-tPA（50 nM）的通透性增加被PMX205（50 μM）抑制70%（p < 0.005）（图7），但效力低于t-PA。
     

5. 延时给药的有效性

   • PMX205在t-PA刺激后3小时内给药仍可逆转BBB破坏（图6），具有临床转化潜力。
     

结论与意义

1. 科学价值：首次揭示t-PA/TNK-tPA通过细胞内在C5a-C5aR1通路（非血浆补体）调控BBB通透性，为卒中溶栓的副作用提供了新机制。
   
2. 应用价值：PMX205作为C5aR1抑制剂，可成为辅助治疗药物，降低t-PA溶栓的出血风险。
   
3. 理论创新：提出“细胞内补体”在非免疫细胞（如神经血管单元）中的功能，拓展了补体系统的研究维度。
   

研究亮点

1. 创新模型：结合共培养与单细胞体系，明确BECs为补体调控的主要效应细胞。
   
2. 转化医学：PMX205的延时有效性为临床“时间窗”延长提供实验依据。
   
3. 跨学科整合：将血栓溶解（纤溶系统）、神经血管生物学与补体免疫学交叉研究。
   

其他价值

研究还提示，TNK-tPA虽安全性优于t-PA，但仍需警惕其补体激活潜力，未来需进一步优化溶栓药物设计。