本研究由荷兰阿姆斯特丹自由大学医学中心（VU University Medical Center）临床化学系的Annemieke C. Heijboer领衔，联合荷兰格罗宁根大学医学中心（University Medical Center Groningen）实验室医学系及荷兰Hoofddorp医学诊断中心（Medial Diagnostic Centers）的研究团队共同完成，成果发表于2012年3月的《Clinical Chemistry》期刊（卷58，期3，页码543-548），标题为《Accuracy of 6 Routine 25-Hydroxyvitamin D Assays: Influence of Vitamin D Binding Protein Concentration》。

学术背景

25-羟基维生素D [25(OH)D]是评估维生素D营养状况的金标准指标，其检测准确性对骨质疏松、癌症和自身免疫疾病等疾病的预防与管理至关重要。近年来，临床实验室对25(OH)D检测的需求激增，推动了自动化检测技术的发展。然而，维生素D结合蛋白（Vitamin D–Binding Protein, DBP）的浓度差异可能干扰检测结果——DBP通过与25(OH)D结合影响其生物可利用度，而现有自动化检测方法在释放结合态25(OH)D的效率尚不明确。本研究旨在评估6种常规25(OH)D检测方法（5种全自动免疫分析法与1种放射免疫分析法）与同位素稀释/在线固相萃取液相色谱-串联质谱（ID-XLC-MS/MS）参考方法的差异，并探究DBP浓度对检测结果的影响。

研究流程与实验设计

1. 样本收集与分组

研究纳入四组人群：
- 健康对照组：51例（男23/女28，年龄20-64岁）
- 孕妇组：52例（均为女性，年龄19-40岁，妊娠9-14周）
- 血液透析患者组：50例（男24/女26，年龄33-89岁）
- 重症监护患者组（IC组）：50例（男28/女22，年龄18-89岁）

所有样本均采集EDTA血浆或血清，离心分装后于-20°C保存（不超过2个月），采用盲法分析以避免操作偏倚。

2. 检测方法

• 参考方法：ID-XLC-MS/MS

  • 使用专有蛋白裂解缓冲液释放25(OH)D，氘代内标（25(OH)D3-d6）校正，通过在线固相萃取系统（Spark Holland Symbiosis）与串联质谱仪（Waters Quattro Premier XE）联用分析。
    
  • 定量限（LOQ）为1.6 μg/L（4.0 nmol/L），批内与批间变异系数（CV）分别≤6%和≤8%。
    

• 常规检测方法：

  • 全自动免疫分析法：Abbott Architect、Siemens Centaur、IDS iSYS、DiaSorin Liaison、Roche Elecsys
    
  • 放射免疫分析法（RIA）：DiaSorin RIA（需有机溶剂预提取）
    
  • 除iSYS使用血清外（因厂商声明不适用于血浆），其余均使用EDTA血浆。
    

• DBP浓度检测：采用ELISA（R&D Systems）测定血浆DBP，批内CV为4.3%。

3. 数据分析

• 通过Passing-Bablok回归与Pearson相关系数比较各常规方法与ID-XLC-MS/MS的结果一致性。
  
• 非参数检验分析组间DBP浓度差异，并评估DBP浓度与检测偏差的相关性。

主要结果

1. 方法学差异：

   • 多数免疫分析法（尤其是Architect、Centaur、iSYS、Liaison）与ID-XLC-MS/MS结果存在显著偏差（P<0.05），表现为斜率偏离1.00或截距非零（表1）。例如：
     
     • Centaur在低浓度区间高估、高浓度区间低估25(OH)D（斜率0.37-0.62）。
       
     • 孕妇组中Architect与iSYS的斜率分别为0.89与0.76，提示高DBP浓度导致低估。
       
   • Roche Elecsys与DiaSorin RIA的偏差较小，可能与前者使用重组DBP竞争结合、后者采用彻底提取步骤有关。
     

2. DBP浓度影响：

   • 孕妇组DBP浓度显著高于健康对照组（358 vs. 275 μg/ml，P<0.001），而IC组显著降低（155 μg/ml）。
     
   • 4种全自动免疫分析法（Architect、Centaur、iSYS、Liaison）的检测偏差与DBP浓度呈负相关（r=-0.45至-0.72，P<0.005，图3），表明高DBP导致25(OH)D释放不完全。
     

3. 临床意义差异：

   • 以50 nmol/L为充足阈值，ID-XLC-MS/MS测得67%孕妇充足，而Centaur与iSYS仅24-25%；IC组充足率从参考方法的20%升至Liaison的52%，凸显方法选择对临床决策的影响。
     

结论与价值

1. 科学价值：

   • 首次系统性验证DBP浓度对常规25(OH)D检测的干扰机制，揭示全自动免疫分析法在高DBP样本中的局限性。
     
   • 强调标准化的重要性，推荐以ID-XLC-MS/MS或经严格验证的RIA作为校准依据。
     

2. 应用价值：

   • 临床实验室需根据患者群体（如孕妇、重症患者）选择适宜检测方法，避免误判维生素D状态。
     
   • 厂商需优化试剂以改善DBP结合干扰，如Siemens已计划调整Centaur试剂的低浓度区间性能。
     

研究亮点

• 创新性：首次在多中心、多人群中平行比较6种常规方法与质谱法的性能，并量化DBP干扰效应。
  
• 临床相关性：明确不同检测方法对维生素D充足率判读的显著差异，为指南制定提供实验依据。
  
• 技术严谨性：采用候选参考方法（Thienpont组开发）验证ID-XLC-MS/MS的准确性，确保数据可靠性。
  

其他发现

• 血液透析患者组虽DBP浓度正常，但所有常规方法均出现浓度依赖性偏差（斜率0.60-0.82），提示尿素等代谢物可能干扰检测，需进一步研究。
  
• 仅5.4%样本含25(OH)D2（浓度1.2-6 μg/L），表明维生素D2补充在欧洲不常见，其交叉反应性问题未显著影响本研究结论。
  

本研究为维生素D检测的标准化与临床应用提供了关键证据，推动了对检测方法局限性的认知与改进。