本研究由内蒙古工业大学化工学院、内蒙古合成生物学重点实验室以及金宇保灵生物药品有限公司的研究人员合作完成。主要作者包括 Donghao Hao、Sie Han、Yan Wang、Jie Li、Lixia Liu 和 Zhanying Liu。该论文以预印本形式于 2026 年在 Scientific Reports 上先行发表，并携带永久 DOI（https://doi.org/10.1038/s41598-026-76921-y）。
一、研究背景与目的
多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, *P. multocida*）是一种广泛分布于家养及野生动物上呼吸道的条件性致病菌，可感染牛、猪、家禽等多种动物。在牛群中，该菌是牛呼吸道疾病综合征（bovine respiratory disease, BRD）和“运输热”的重要病原之一，常导致慢性纤维素性支气管肺炎，严重损害畜牧业生产效益。此外，该菌具有一定的人兽共患潜力，对公共卫生构成威胁。感染后，反刍动物可迅速产生针对多种细菌蛋白的高滴度抗体，因此血清学检测可用于群体水平的抗体监测及疫苗免疫效果评价。然而，抗体的存在本身并不能区分自然感染与疫苗接种。间接酶联免疫吸附试验（indirect ELISA）可高通量检测血清样本，已有研究利用天然混合外膜蛋白（outer membrane protein, OMP）提取物建立了牛源间接 ELISA。本研究则聚焦于重组表达的 OmpA 蛋白，旨在以更具抗原靶向性的方式开发用于检测抗多杀性巴氏杆菌抗体的间接 ELISA 方法，并进行初步评估。
二、研究流程与方法
本研究主要包括四个阶段：候选膜蛋白的筛选与表达、间接 ELISA 的建立与条件优化、分析性能评估以及开发队列的初步评价。
第一阶段：候选膜蛋白的筛选与表达。 研究团队从实验室保存的牛源荚膜 A 型多杀性巴氏杆菌（PMA）分离株中获取了 *ompA*、*ompW*、omph-1 和 omph-2 四个候选膜蛋白基因。该 PMA 分离株来自某发病牛场的鼻腔拭子，其荚膜类型通过多重 PCR 确认。四个基因经 PCR 扩增后，分别通过 Nde I 和 Hind III 酶切位点克隆至 pET-30a 表达载体，并转化至大肠杆菌 BL21 中进行原核表达。SDS-PAGE 分析表明，四种重组蛋白均主要以包涵体（inclusion body）形式表达。随后对包涵体进行尿素变性和稀释复性处理。其中，OmpA 的复性方式为将变性蛋白十倍稀释至含 50 mM NaH₂PO₄、500 mM NaCl、2 M 尿素、1 mM 胱氨酸和 3 mM 半胱氨酸的复性缓冲液中，于 4 °C 搅拌孵育 16 小时。Western blotting 显示，稀释复性后的 OmpA 制备物仍能与多杀性巴氏杆菌阳性血清反应。在间接 ELISA 筛选中，以阳性/阴性比值（P/N）大于 2.1 作为候选包被抗原的筛选标准，结果只有 OmpA 制备物满足该标准，而 OmpW、Omph-1 和 Omph-2 的 P/N 值均低于 2.1。因此，OmpA 被经验性地选为后续 ELISA 开发的包被材料。
第二阶段：间接 ELISA 的建立与条件优化。 采用棋盘滴定法对包被浓度、封闭条件、一抗和二抗稀释度及孵育时间、显色时间等关键参数进行系统优化。最终确定的优化条件为：OmpA 复性制备物的名义总蛋白包被浓度为 1 µg/ml；使用 1% 脱脂乳在 37 °C 封闭 1 小时；血清一抗稀释度为 1:400，孵育 1 小时；辣根过氧化物酶标记的山羊抗牛 IgG 二抗稀释度为 1:25,000，孵育 45 分钟；显色时间为 15 分钟。为建立初步判定阈值，研究使用了 60 份血清开发队列中的 20 份预先定义的阴性参考血清。在优化条件下，这 20 份阴性血清的平均 OD₄₅₀ 值为 0.171，标准差为 0.074。据此，阴性判定下限阈值设定为均值加两倍标准差（0.318），阳性判定上限阈值设定为均值加三倍标准差（0.392），介于两者之间者判定为不确定。
第三阶段：分析性能评估。 分析特异性评估采用了实验室保存的血清反应性组合，包括同源的 PMA 阳性血清、一株荚膜 B 型多杀性巴氏杆菌（PMB）阳性血清，以及针对牛支原体、溶血性曼氏杆菌、金黄色葡萄球菌、睡眠嗜组织菌、副猪嗜血杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛呼吸道合胞体病毒的阳性血清。结果显示，PMA 阳性血清呈阳性反应，而 PMB 阳性血清和其余八种其他病原体的阳性血清的 OD₄₅₀ 值均低于阴性判定下限阈值。PMB 阳性血清的平均 OD₄₅₀ 值为 0.053。但作者明确指出，由于仅评估了一份 PMB 阳性血清，且未包含 D、E、F 荚膜型的血清，该结果不能证明对 B 型或其他荚膜型无交叉反应，也不能证明该 ELISA 具有 A 型特异性。在倍比稀释实验中，PMA 阳性血清在 1:1280 稀释度下仍保持阳性。重复性评估采用两份免疫后血清和两份阴性参考血清，每份重复三次，结果显示批内和批间变异系数（coefficient of variation, CV）均低于 5%。
第四阶段：开发队列初步评估。 开发队列包含 60 份牛血清样本，来自同一牛场同一出生队列的 3–4 月龄当地黄牛。其中 40 份为免疫后血清，采集自第二次免疫后 14 天、攻毒前的牛只；20 份为预先定义的阴性参考血清，采集自初次免疫前。这些牛在免疫前临床正常，无多杀性巴氏杆菌疫苗接种史。免疫方案为接种合作公司制备的多杀性巴氏杆菌灭活疫苗，共两剂，间隔 7 天。ROC 曲线分析基于连续 OD₄₅₀ 值和预先定义的组别标签，结果显示曲线下面积（area under the curve, AUC）为 0.969（近似 95% 置信区间为 0.928–1.000）。在 0.392 的二分类判定阈值下，分类结果包含 38 例真阳性、2 例假阴性、19 例真阴性和 1 例假阳性。据此计算的表观灵敏度为 95.00%（38/40；精确 95% 置信区间为 83.08–99.39%），表观特异度为 95.00%（19/20；精确 95% 置信区间为 75.13–99.87%）。作者强调，由于用于阈值建立的 20 份阴性参考血清同时被用作 ROC 分析中的阴性参考组，这一非独立性可能导致性能估计偏乐观，结果仅代表开发队列内部的探索性评估，不能推广至自然感染牛群或更广泛的田间群体。
三、结论与意义
本研究成功原核表达了牛源多杀性巴氏杆菌重组 OmpA 蛋白，并利用稀释复性后保持血清反应性的 OmpA 制备物作为包被材料，建立了一种间接 ELISA 方法。优化后的条件包括 1 µg/ml 名义总蛋白包被浓度、1% 脱脂乳封闭、血清 1:400 稀释、二抗 1:25,000 稀释以及 15 分钟显色。在评估的血清反应性组合中，PMA 阳性血清呈阳性反应，而 PMB 阳性血清及其他测试病原体的阳性血清均低于阴性阈值。PMA 阳性血清在 1:1280 稀释下仍保持阳性，批内和批间变异系数均低于 5%。在疫苗接种定义的 60 份血清开发队列中，AUC 为 0.969，表观灵敏度和特异度均为 95.00%。
从科学价值来看，本研究提供了一种以重组 OmpA 为靶向抗原的检测策略，相较于以往使用天然混合外膜蛋白提取物的方法更具抗原针对性，为多杀性巴氏杆菌抗体监测提供了新的技术选择。从应用价值来看，该 ELISA 方法在群体水平抗体监测和疫苗免疫应答评价方面具有潜在应用前景。然而，作者明确指出该方法的若干重要局限：首先，该方法不能区分自然感染与灭活疫苗接种产生的抗体，也不能用于 DIVA（differentiating infected from vaccinated animals）策略，除非结合合适的标记抗原或标记疫苗策略；其次，交叉荚膜反应性尚未充分解决，仅评估了一份 B 型阳性血清；第三，OmpA 制备物的定量纯度、质谱鉴定、天然结构完整性、复性回收率以及不同批次间的重现性均未系统评估，包被浓度仅为名义总蛋白浓度；第四，抗原和包被板的储存稳定性及货架期尚未确定。因此，该研究属于概念验证和初步开发阶段，未来需通过独立的多中心验证、更全面的血清组合评估以及更深入的生化表征来确立其外部诊断性能。
四、研究亮点
本研究的亮点在于：第一，在相同筛选条件下系统比较了四种重组膜蛋白制备物的 ELISA 性能，并经验性地筛选出 OmpA 作为包被抗原，体现了以实证数据为导向的抗原选择策略；第二，建立了一套完整的间接 ELISA 优化与初步评估流程，从棋盘滴定、阈值确定到分析特异性和重复性评估，逻辑清晰、数据详实；第三，对研究结果的局限性进行了充分而坦诚的讨论，包括样本独立性不足、交叉荚膜反应性未充分验证、抗原制备物表征不完整等，体现了严谨的科学态度。此外，研究使用来自单一牛场同一出生队列的黄牛样本，虽然限制了结果的普适性，但在一定程度上控制了遗传和环境变异对免疫应答的干扰，为后续扩大验证提供了基础数据。