METTL3、m6A修饰与EGR1的相互作用影响心肌缺血/再灌注损伤结局的研究报告

一、研究概述

本研究由郑州大学第一附属医院心血管外科的Chen Huang、Xun Zhang、Shi-Xiong Wu、Qing Chang、Zhi-Kun Zheng及通讯作者Jing Xu（邮箱：fccxuj@zzu.edu.cn）共同完成。该研究成果发表于*Cell Biology and Toxicology*期刊2025年第41卷，文献编号为7。

二、学术背景与研究目的

心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤是临床心脏病再灌注治疗中面临的重大障碍，其发病机制尚未完全阐明。早期生长反应因子1（early growth response 1，EGR1）是一种在细胞增殖、分化、存活和凋亡中发挥重要作用的转录因子。既往研究表明，抑制EGR1可减轻心肌I/R损伤，但其精确的调控通路仍需进一步阐明。线粒体自噬（mitophagy）作为维持细胞线粒体质量和功能的关键过程，对心肌I/R损伤具有显著影响。在心血管疾病中，N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）RNA甲基化通过其调控因子甲基转移酶样3（methyltransferase like 3，METTL3）发挥重要作用。本研究旨在探讨EGR1调控线粒体自噬介导的心肌细胞焦亡（pyroptosis）的分子通路及其对心肌I/R损伤的影响，重点阐明METTL3介导的m6A修饰在其中的调控机制。

三、详细研究流程

本研究采用了体外与体内相结合的实验策略，主要包括以下实验程序：

1. 原代心肌细胞提取与缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤模型的构建

研究人员从1-2日龄C57BL/6小鼠乳鼠心脏中提取原代心肌细胞，经胰蛋白酶和胶原酶消化、过滤、离心后，接种于预包被黏附蛋白的培养皿中。通过α-SCA抗体免疫荧光鉴定心肌细胞纯度大于95%。体外H/R损伤模型通过将心肌细胞置于含1% O₂、94% N₂和5% CO₂的模块化培养箱中缺氧24小时，随后在95%空气和5% CO₂环境中复氧12小时构建，以模拟体内I/R损伤。

2. 细胞分组与基因干预

实验中设置了17个细胞分组，包括对照组、H/R组、以及转染短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）靶向敲低EGR1（shEGR1）、METTL3（shMETTL3）或胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 2，IGF2BP2）（shIGF2BP2）的各处理组。此外，还设置了使用线粒体自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA，5 mM）和JAK2/STAT3通路特异性抑制剂AG490（50 μM）的处理组，以及EGR1过表达质粒（EGR1-OE）与shMETTL3或shIGF2BP2的共转染组。转染采用Lipofectamine™ 3000转染试剂，质粒浓度为50 nM，转染48小时后通过RT-qPCR验证敲低或过表达效率。

3. 体内小鼠心肌I/R损伤模型的建立

实验选用8-10周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠（体重20-26克），随机分为四组：Sham+shNC+NC-OE组、I/R+shNC+NC-OE组、I/R+shMETTL3+NC-OE组和I/R+shMETTL3+EGR1-OE组，每组14只。在构建I/R模型前3天，通过心肌内注射将10 μL滴度为1.5×10⁵ TU/mL的腺病毒载体注入各组小鼠心肌。I/R模型通过异氟烷麻醉后气管插管，结扎左前降支（left anterior descending，LAD）冠状动脉30分钟诱导缺血，随后释放结扎线进行60分钟再灌注。通过心电图ST段抬高确认缺血成功，ST段回落确认再灌注成功。Sham组除不结扎LAD外其余操作相同。每组6只小鼠在I/R构建7天后用于心脏功能评估，剩余8只用于Evans蓝/TTC染色及心脏和血清样本收集。

4. 检测指标与实验方法

本研究采用了多种实验技术手段：（1）心脏功能检测通过小动物超声系统（Fujifilm Vevo 3100，40 MHz探头）测量左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）；（2）心肌梗死面积通过Evans蓝/TTC双染色评估，计算梗死区（infarct area，INF）/危险区（area at risk，AAR）及AAR/左心室（left ventricle，LV）比值；（3）细胞活力通过CCK-8法检测；（4）心肌损伤标志物心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）和肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase MB，CK-MB）及炎症因子IL-1β、IL-18通过ELISA检测；（5）RT-qPCR检测mRNA表达，GAPDH作为内参；（6）Western blot检测自噬相关蛋白（LC3、p62、PINK1、Parkin）、线粒体分裂蛋白（DRP1、FIS1、MFF）、融合蛋白（OPA1、MFN1、MFN2）、JAK2/STAT3通路蛋白（JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3）和焦亡标志物（cleaved-caspase 1、N-GSDMD、IL-1β、IL-18）等蛋白表达；（7）透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）观察线粒体超微结构和细胞膜形态；（8）免疫荧光共定位实验检测自噬体（GFP-LC3B）与线粒体（MitoTracker Red）及溶酶体（LysoTracker）与线粒体的共定位；（9）m6A定量通过m6A RNA甲基化检测试剂盒完成，m6A免疫沉淀（MeRIP）用于检测EGR1 mRNA的m6A修饰水平；（10）RNA稳定性实验使用链霉溶菌素（streptolydigin，5 μg/mL）抑制转录后检测EGR1 mRNA的降解速率；（11）RNA免疫沉淀（RIP）实验检测IGF2BP2与EGR1 mRNA的直接结合；（12）双荧光素酶报告基因实验验证IGF2BP2与EGR1 mRNA m6A位点（1184位点，A到U突变）的结合依赖性。

四、主要研究结果

1. EGR1沉默改善心肌I/R损伤模型中的线粒体自噬功能障碍和线粒体动力学失衡

H/R处理后，心肌细胞活力显著下降，cTnI和CK-MB水平升高，EGR1 mRNA和蛋白表达显著上调。TEM显示H/R组心肌细胞线粒体显著肿胀、空泡化和嵴断裂。免疫荧光共定位显示H/R处理后自噬体与线粒体及溶酶体与线粒体的共定位斑点减少。Western blot显示H/R处理显著降低PINK1、Parkin和LC3II/LC3I水平，同时升高p62表达，表明H/R导致线粒体自噬功能障碍。转染shEGR1敲低EGR1后，线粒体形态损伤得到恢复，共定位斑点数量增加，PINK1、Parkin和LC3II/LC3I表达上调而p62下调。3-MA处理逆转了EGR1敲低对线粒体自噬的促进作用及其对心肌细胞损伤的保护效果。此外，EGR1敲低恢复了H/R诱导的线粒体呼吸复合物（UQCRC2、SDHB、MTCO2）表达下调，改善了ATP产生和线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP），降低了总ROS和线粒体ROS水平，并恢复了抗氧化酶（GPX、GSH、SOD）水平。Western blot显示H/R促进线粒体分裂蛋白（DRP1、FIS1、MFF）表达上调，抑制融合蛋白（OPA1、MFN1、MFN2）表达，而EGR1敲低逆转了这一效应。免疫荧光染色（TOM20）证实EGR1沉默恢复了线粒体平均长度，改善了线粒体碎片化。

2. EGR1沉默通过诱导JAK2/STAT3通路促进线粒体自噬并减轻心肌细胞损伤

Western blot显示H/R处理抑制了JAK2和STAT3的磷酸化。EGR1敲低消除了H/R对JAK2/STAT3通路激活的抑制作用，而使用AG490处理逆转了shEGR1对JAK2/STAT3通路的激活效应。AG490取消了shEGR1对线粒体形态的改善作用，阻断了自噬体与线粒体及溶酶体与线粒体共定位的增加，并恢复了线粒体自噬相关蛋白的表达变化。AG490还逆转了shEGR1对ATP产生、MMP、线粒体呼吸复合物表达、ROS水平和抗氧化酶水平的改善作用，并逆转了线粒体分裂/融合蛋白的变化。细胞活力和损伤标志物检测表明AG490逆转了EGR1沉默的保护效应。

3. EGR1抑制线粒体自噬促进心肌细胞焦亡

SEM结果显示H/R组心肌细胞表面出现肿胀、大量气泡状突起和膜孔形成等典型焦亡形态学特征，shEGR1改善了这些形态学变化，而AG490逆转了这种改善。TUNEL染色显示EGR1敲低降低了H/R诱导的TUNEL阳性细胞百分比，AG490消除了这一效应。LDH释放结果与此趋势一致。Western blot显示EGR1敲低恢复了H/R诱导的cleaved caspase-1、N-GSDMD/GSDMD、IL-1β和IL-18的表达上调，AG490处理阻断了这一抑制效应。ELISA检测细胞上清中IL-1β和IL-18浓度结果与之相符。3-MA处理也消除了shEGR1对焦亡的改善作用。这些结果表明EGR1通过JAK2/STAT3通路抑制线粒体自噬，从而促进心肌细胞焦亡。

4. METTL3介导的m6A修饰调控心肌细胞损伤中EGR1的表达

H/R处理后，METTL3 mRNA和蛋白表达显著上调，总m6A水平升高，EGR1 mRNA的m6A修饰水平增加。通过SRAMP网站预测EGR1 mRNA存在4个高置信度的m6A修饰位点。转染shMETTL3敲低METTL3后，H/R诱导的EGR1 mRNA和蛋白表达上调被抑制，MeRIP分析证实shMETTL3显著抑制了EGR1 mRNA的m6A修饰水平。这些结果确认EGR1是METTL3介导的m6A修饰的靶标mRNA。

5. METTL3和IGF2BP2通过m6A修饰调控EGR1 mRNA的稳定性

RNA稳定性实验显示，敲低METTL3显著加速了EGR1 mRNA的降解，表明m6A修饰增强了EGR1 mRNA的稳定性。转染shIGF2BP2敲低IGF2BP2后，H/R损伤心肌细胞中EGR1的mRNA和蛋白表达均下调，RNA稳定性分析显示EGR1 mRNA降解加速。RIP实验证实IGF2BP2与EGR1 mRNA存在直接结合，且METTL3沉默逆转了H/R处理对IGF2BP2与EGR1 mRNA结合的促进作用。双荧光素酶报告基因实验显示，当IGF2BP2被沉默时，野生型EGR1（EGR1#WT）的荧光素酶活性显著下降，而突变型EGR1（EGR1#MUT，m6A位点A到U突变）的荧光素酶活性无统计学显著差异。这证实IGF2BP2以m6A修饰依赖性方式直接结合EGR1 mRNA，增强其稳定性并上调其表达。

6. METTL3通过EGR1/JAK2/STAT3通路促进心肌细胞焦亡和损伤

TEM显示shMETTL3保护了心肌细胞线粒体免受H/R诱导的损伤，但EGR1-OE抵消了这一保护作用。免疫荧光共定位显示shMETTL3增加了自噬体与线粒体及溶酶体与线粒体的共定位斑点，EGR1-OE处理阻断了shMETTL3的促线粒体自噬效应。Western blot显示shMETTL3上调了PINK1、Parkin和LC3II/LC3I表达并下调p62，EGR1-OE恢复了这些蛋白的变化水平。体内实验中，I/R+shMETTL3+NC-OE组小鼠心脏功能（LVEF和LVFS）较I/R+shNC+NC-OE组显著改善，心肌梗死面积减小，心肌组织病理损伤减轻。重要的是，共转染EGR1-OE逆转了shMETTL3对心脏的保护效应。此外，shMETTL3抑制了I/R诱导的心肌细胞焦亡标志物表达，而EGR1-OE恢复了焦亡水平。shIGF2BP2与EGR1-OE的共转染实验得出了相似的结论。

五、结论与研究价值

本研究首次系统阐明了METTL3/m6A/IGF2BP2/EGR1/JAK2/STAT3/线粒体自噬/焦亡这一完整的分子调控轴在心肌I/R损伤中的致病机制。具体而言，在心肌I/R损伤中，METTL3介导EGR1 mRNA的m6A修饰，IGF2BP2以m6A依赖方式结合EGR1 mRNA并增强其稳定性，导致EGR1表达上调。升高的EGR1抑制JAK2/STAT3通路激活，进而抑制线粒体自噬，导致线粒体动力学失衡和线粒体功能障碍，最终促进心肌细胞焦亡和心肌I/R损伤加重。本研究丰富了心肌I/R损伤的病理生理学机制认识，为临床防治心肌I/R损伤提供了新的潜在治疗靶点，具有重要的科学价值和应用前景。

六、研究亮点

本研究的亮点在于：（1）首次完整揭示了METTL3介导的m6A修饰通过IGF2BP2识别机制上调EGR1表达，进而通过JAK2/STAT3通路调控线粒体自噬和焦亡的级联分子通路；（2）综合运用了体外H/R模型和体内心肌I/R模型，从细胞、分子和整体动物水平多层次验证了该通路的功能；（3）采用了多种前沿技术手段，包括MeRIP、RIP、RNA稳定性实验和双荧光素酶报告基因实验，系统验证了m6A修饰调控EGR1表达的分子机制；（4）将表观转录组学修饰（m6A）与线粒体自噬、细胞焦亡和心肌I/R损伤联系起来，建立了新的机制框架，为表观遗传调控在心血管疾病中的研究提供了新范式。