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研究作者与发表信息
本研究由西湖大学（Westlake University）的曹龙兴（Longxing Cao）课题组主导，第一作者为于博文（Bowen Yu），合作单位包括山东第二医科大学、杭州电子科技大学、北京大学等。该研究成果于2025年8月28日在线发表于国际顶级学术期刊《自然·化学》（nature chemistry）。
研究背景与目的
光响应蛋白在生命体中扮演着感知和响应环境光信号的关键角色，是光遗传学和光生物化学的核心工具。传统的设计策略大多通过改造天然存在的光受体（如LOV结构域或光敏色素）来实现光控功能，但这些蛋白的架构和机制被其天然生物学功能所局限。从头设计具有全新架构和可逆响应行为的蛋白质，一直是该领域一项未竟的重大挑战。
本研究旨在开发一种通用的计算方法，通过将基因密码子扩展技术与计算蛋白设计相结合，从头设计由非经典氨基酸——光响应的苯丙氨酸-4’-偶氮苯（简称AzoF）——调控的蛋白质-蛋白质相互作用界面。该研究的核心目标是构建仅在AzoF处于反式（trans）构型时组装，并在其光致异构化为顺式（cis）构型时解离的蛋白质组件，从而实现对蛋白质组装体的光学可逆控制。
详细研究流程
本研究的工作流程主要包括以下几个步骤：计算设计方法开发、光控环状同源寡聚体（cyclic homo-oligomers）的设计与表征、光控异源二聚体（heterodimers）的设计与表征、光控水凝胶的构建，以及光控配体-受体系统在哺乳动物细胞中的应用。
1. 计算设计方法的开发 研究者首先构建了一个包含大量三螺旋或四螺旋束蛋白的支架库，每个支架由65个氨基酸组成。为了精确地将AzoF整合到蛋白质界面核心，研究团队开发了一套全新的算法流程。 第一步，他们生成了“相对AzoF相互作用场”。他们用疏水性氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）重新设计了支架蛋白的表面，然后利用RifGen方法将脱离的AzoF残基对接到这些疏水支架表面，快速评估并存储了每个位置上AzoF与支架蛋白形成有利非极性相互作用的骨架坐标信息。 第二步是开发了一种蒙特卡洛对接方法。此方法不仅依赖传统的基于残基对变换评分（RPX score）的蛋白-蛋白相互作用能评估，还整合了“相对AzoF相互作用场”的快速查找功能。这允许算法在确定两个蛋白的相对位置时，立刻判断其中一个蛋白是否可以整合一个AzoF残基以与相邻亚基产生有利作用。 第三步是对成功整合了跨式AzoF且界面相互作用良好的对接构型进行序列优化。他们使用了Rosetta和ProteinMPNN来优化界面形状和化学互补性，并有意引入偏向于极性氨基酸的设计，以增强未结合界面的亲水性，防止非特异性聚集。 最终，筛选出在AzoF为跨式构型时界面相互作用有利，而在顺式构型下会产生严重空间位阻的结构，进入实验表征阶段。
2. 光控环状同源寡聚体的设计与表征 研究者将上述方法应用于C2至C5对称性的环状同源寡聚体设计。他们合成了对应于200个设计的基因，并在大肠杆菌中使用正交的氨酰tRNA合成酶/tRNA对，将AzoF定点整合到琥珀终止密码子对应的位置。 实验结果显著：在回收的116个呈现黄色（表明AzoF成功掺入）的设计中，22个在分子排阻色谱（SEC）中显示出预期的寡聚化状态。通过340纳米和420纳米波长的光照射实验，最终证实13个设计具有光响应性，其中7个实现了近乎完全的组装-解离。例如，LRO-C2-5（二聚体）、LRO-C3-7（三聚体）和LRO-C4-13（四聚体）在340纳米光照下几乎完全解离为单体，再用420纳米光照后可重新组装。分析性超速离心实验进一步确认了这种可逆过程。紫外-可见吸收光谱确认了蛋白质内部的偶氮苯基团能高效地在两种构型间切换。圆二色光谱（CD）实验则表明这些设计蛋白具有极高的热稳定性（高达95°C）。 结构是设计的最终验证。研究者对表面残基进行突变以促进结晶，成功解析了LRO-C2-5、LRO-C3-7、LRO-C4-13和LRO-C5-1的晶体结构。这些晶体结构与计算设计模型高度吻合，骨架碳α原子的均方根偏差（Cα RMSD）值分别为1.45 Å、1.01 Å、1.74 Å和1.13 Å。电子密度图清晰地展示了AzoF的构型及其与周围残基形成的紧凑疏水相互作用。
3. 光控异源二聚体的设计与表征 为拓展方法的通用性，团队设计了光控异源二聚体，命名为LRD。他们将含有AzoF的链（LRD-Xa）与不含AzoF的“普通”链（LRD-Xv）通过双顺反子系统共表达。在筛选的36个设计中，3个（LRD-2、LRD-7、LRD-10）表现出显著的光响应性。在自然状态下，它们结合为二聚体；340纳米光照后解离为单体；420纳米光照后重新组装。 生物膜干涉技术精确测定了其结合动力学，这些二聚体在自然状态下具有纳摩尔级的亲和力。340纳米光照后，其亲和力急剧下降，其中LRD-7的结合亲和力变化高达167倍。经过多个光循环后，其低亲和力与高亲和力状态的转换完全可逆。此外，若将界面的AzoF突变为丙氨酸或苯丙氨酸，相互作用几乎完全消失，这凸显了AzoF在界面中的核心作用。这些异源二聚体还表现出高度的正交性，每个AzoF链只与其对应的普通链结合，特异性堪比天然蛋白。LRD-2和LRD-7的晶体结构也以原子级精度（Cα RMSD分别为0.61 Å和0.98 Å）证实了设计模型。
4. 光控水凝胶的构建 利用从头设计的光控五聚体LRO-C5-1，研究者构建了一个独特的光控蛋白水凝胶系统。他们将LRO-C5-1融合上麦芽糖结合蛋白（MBP）和SpyTag，与一个融合了SpyCatcher的二聚体蛋白混合，通过SpyTag/SpyCatcher间的共价交联形成水凝胶。在340纳米光照射下，由于LRO-C5-1解离，水凝胶转变为液滴状流体；再经420纳米光照射，水凝胶重新形成，实现了可逆的溶胶-凝胶转变。流变学分析显示，该水凝胶的储能模量在光照后发生约10倍的改变，且这种可逆的模量变化能稳定重复至少12个完整循环。
5. 光控配体-受体对的设计与应用 最后，团队利用高响应性的异二聚体LRD-7，在哺乳动物细胞中设计了一个光控合成配体-受体系统。他们将LRD-7v融合到GEMS受体的胞外域，并将LRD-7a二聚化以制备配体。当配体结合受体时，会触发细胞内JAK/STAT、MAPK和PLCG信号通路。实验结果显示，加入二聚化配体能有效激活报告基因（SEAP）的表达。若配体预先经340纳米光照处理，其激活信号通路的能力显著下降。而在特定时间点对细胞和失活配体的混合物进行420纳米光照，则可观察到受体活性的逐渐恢复，实现了对细胞信号传导的精确时间控制。这项工作为在治疗和诊断领域扩展光遗传学的应用提供了可能性。
结论与研究价值
本研究首次实现了一种通用的、可编程的计算策略，能够从头设计由非经典氨基酸AzoF精确调控的蛋白质-蛋白质相互作用。该方法的科学价值在于，它将蛋白质设计的化学空间拓展到了常规20种氨基酸之外，为创建动态、可控的蛋白质相互作用开辟了新路径。通过识别设计成败的关键因素，如AzoF在界面的埋藏深度和未结合面亲水性等，为未来更高效的设计提供了指导。
应用价值体现在，这些从头设计的蛋白展现出了超越天然光敏蛋白的优势：体积更小、更稳定、机制更简单、架构更多样。研究团队成功展示了其在构建智能生物材料（光控水凝胶）和细胞行为光遗传学控制中的巨大潜力。
研究亮点