主要作者及研究机构
本研究由Muhammad Saad Yousuf、Myung-Chul Noh、Timothy N. Friedman、Kasia Zubkow、John Christy Johnson、Gustavo Tenorio、Harley T. Kurata、Peter A. Smith和Bradley J. Kerr共同完成。研究团队来自加拿大阿尔伯塔大学（University of Alberta）的神经科学与心理健康研究所（Neuroscience and Mental Health Institute）、药理学系（Department of Pharmacology）以及麻醉学与疼痛医学系（Department of Anesthesiology and Pain Medicine）。该研究于2019年3月20日首次发表于 eNeuro 期刊，文章编号为e0024-19.2019，DOI为https://doi.org/10.1523/eneuro.0024-19.2019。
研究背景
多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）是一种针对中枢神经系统（central nervous system，CNS）的自身免疫性脱髓鞘疾病。MS患者通常表现为视觉、运动和感觉功能缺损，但超过一半的患者在病程中还会经历神经病理性疼痛（neuropathic pain），这种疼痛与残疾、抑郁和焦虑密切相关，严重影响患者生活质量，而现有治疗手段效果有限。长期以来，MS的病理特征被认为主要局限于中枢神经系统，然而近年来越来越多的证据表明，位于外周的感觉神经元——尤其是背根神经节（dorsal root ganglia，DRG）和三叉神经节（trigeminal ganglia，TG）中的神经元——在慢性中枢炎症过程中也发生显著变化。
为了研究MS中疼痛的免疫介导病理生理机制，研究者采用了髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠模型。MOG-EAE是研究MS最常用的T细胞介导动物模型。感觉神经元在伤害性信号转导中起关键作用，因此本研究聚焦于腰段DRG感觉神经元在该疾病状态下的病理变化和电生理特性改变。本研究的核心目标是确定MOG-EAE是否会影响外周感觉神经元的免疫状态、细胞结构完整性以及电生理兴奋性，从而为MS相关疼痛的外周机制提供直接证据。
研究流程与实验方法
本研究采用了从组织病理、分子生物学到电生理学的多层次研究策略。
实验动物与EAE诱导：研究使用8至10周龄雌性C57BL/6小鼠（共90只）。MOG-EAE通过皮下注射MOG35-55肽（50 µg）与完全弗氏佐剂（complete Freund‘s adjuvant，CFA）的乳化物进行诱导，并在诱导当天及48小时后腹腔注射百日咳毒素（pertussis toxin）。对照组小鼠仅接受CFA和百日咳毒素处理。小鼠根据临床评分分为两组：发病期（onset，出现临床症状时，评分1级）和慢性期（chronic，诱导后第21天，平均评分2.67）。
组织采集与处理：小鼠经戊巴比妥过量安乐死后，进行心内灌注。免疫组化（immunohistochemistry，IHC）实验使用4%多聚甲醛灌注固定，其余实验则快速提取腰段DRG（L3-L6）并在液氮中速冻保存。
分子生物学分析：研究通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测腰椎DRG中补体系统成分（C3、C3ar1、C5ar1）、NLRP3炎症小体相关分子（NLRP3、caspase-1）及炎症细胞因子（IL-1β、IL-18）的mRNA水平。同时检测坐骨神经（sciatic nerve，SN）、DRG和脊髓背角（dorsal spinal cord，DSC）中髓鞘蛋白（MBP、PMP22、MPZ、MOG）的转录水平。Western blotting用于检测细胞骨架蛋白（非磷酸化神经丝重链NFH、tau、驱动蛋白kinesin、β-微管蛋白β-tubulin、β-肌动蛋白β-actin）的蛋白表达水平。
免疫组化分析：IHC用于检测C5aR1阳性免疫细胞、CD4阳性T细胞和Iba1阳性巨噬细胞在DRG中的浸润情况，以及磷酸化神经丝重链（p-NFH）在DRG神经元中的表达和形态学变化。ATF3（激活转录因子3）被用作神经元损伤的标志物。
电生理记录：研究采用全细胞膜片钳（whole-cell patch-clamp）技术在电流钳模式下记录分离培养的DRG神经元电生理特性。DRG神经元经胰蛋白酶和胶原酶消化后培养2至6小时。通过450 ms去极化电流斜坡（ramp）刺激评估神经元放电数量，通过5 ms方波电流脉冲测定基强度（rheobase），并测量动作电位（action potential，AP）的峰值幅度、后超极化幅度（afterhyperpolarization）、半峰宽（half width）、上升斜率（rise slope）和衰减斜率（decay slope）等参数。根据p-NFH免疫标记结果，以26 µm为阈值将神经元分为小直径（<26 µm）和中大直径（≥26 µm）两类。
数据分析：所有数据使用GraphPad Prism 6进行统计分析。多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey事后检验，两组比较采用Student‘s t检验。PCR和Western blotting数据经log2转换以满足正态性和方差齐性假设。p<0.05视为具有统计学显著性。
主要研究结果
DRG中的免疫激活与炎症反应：qRT-PCR分析显示，与CFA对照组相比，MOG-EAE小鼠DRG中补体成分C3、其受体C3ar1以及C5a受体C5ar1的mRNA水平在发病期显著升高。C3 mRNA在慢性期仍保持升高但较发病期有所下降。NLRP3炎症小体组分NLRP3、caspase-1以及细胞因子IL-1β和IL-18的mRNA在发病期均显著上调，其中NLRP3、caspase-1和IL-1β在慢性期仍保持轻度升高，IL-18在慢性期恢复至正常水平。免疫组化进一步证实，C5aR1阳性免疫细胞、CD4阳性T细胞和Iba1阳性巨噬细胞在发病期DRG中数量显著增加，但到慢性期均恢复至基线水平。这些结果表明，免疫细胞向DRG的浸润是一个伴随疾病临床体征出现的短暂现象。
外周髓鞘蛋白未发生显著变化：坐骨神经和DRG中MBP、PMP22和MPZ的mRNA水平在整个病程中未发生显著变化。研究者也未能在坐骨神经中可靠检测到MOG转录本。与之形成对比的是，脊髓背角中MBP、PMP22和MOG的mRNA在发病期显著下调，慢性期恢复正常。这表明在MOG-EAE中，脱髓鞘主要发生在中枢神经系统，外周神经系统并未经历显著的髓鞘蛋白丢失。
神经元损伤与细胞骨架紊乱：ATF3免疫组化显示，与CFA对照组相比，MOG-EAE小鼠DRG神经元中ATF3阳性细胞数量在发病期显著增加，表明外周感觉神经元在疾病过程中遭受了细胞损伤。Western blotting分析显示，发病期DRG中细胞骨架蛋白水平保持完整，但慢性期出现显著异常：非磷酸化NFH蛋白水平大幅升高，而tau、kinesin、β-tubulin和β-actin水平显著下降。免疫荧光染色进一步揭示，慢性期DRG神经元胞体中p-NFH的荧光强度显著降低，且其形态呈现不规则、碎裂状，失去正常有序的晶格结构，进一步证实了慢性期细胞骨架的破坏。
中大直径感觉神经元的兴奋性增高：电生理记录结果显示，小直径（<26 µm）神经元的基强度在各组间无显著差异，而中大直径（≥26 µm）神经元在MOG-EAE发病期基强度显著降低。在2.0 nA电流斜坡刺激下，发病期和慢性期的中大直径神经元放电数量均显著多于CFA对照组；在1.5 nA刺激下，发病期和慢性期也均表现出增多的放电趋势。动作电位分析表明，中大直径神经元在MOG-EAE发病期和慢性期的累积放电潜伏期（cumulative spike latency）显著缩短，表明动作电位连续发放的速度更快。上升斜率在发病期显著降低，慢性期有所恢复。半峰宽在两类神经元中均无显著改变。这些发现一致表明，MOG-EAE选择性地使中大直径DRG感觉神经元变得高兴奋性（hyperexcitable）。
结论与研究意义
本研究提供了确凿的证据，证明MOG-EAE这一传统上被认为仅累及中枢神经系统的疾病模型，实际上在外周神经系统也引发了显著的病理生理改变。DRG经历了短暂的免疫细胞浸润和补体/NLRP3炎症小体激活，神经元发生细胞损伤（ATF3上调），并在慢性期出现细胞骨架蛋白的广泛紊乱。更重要的是，中大直径感觉神经元表现出持续的电生理高兴奋性，包括基强度降低、放电数量增多和累积放电潜伏期缩短。
这些发现具有重要的科学意义和临床价值。从科学角度而言，本研究挑战了MOG-EAE病理仅限于中枢神经系统的传统观念，揭示了外周感觉神经元在MS相关疼痛中可能扮演的主动角色。中大直径神经元通常被认为是传递触觉和本体感觉的机械感受器，其高兴奋性可能导致非伤害性刺激被错误地感知为疼痛（即触诱发痛，allodynia），为理解MS患者机械性痛觉过敏提供了机制性解释。从临床应用角度而言，本研究提示靶向外周感觉神经元的治疗策略——特别是针对中大直径传入纤维的干预——可能为MS神经病理性疼痛的管理提供新的方向。
研究亮点
本研究的亮点在于：首次在MOG-EAE模型中系统描述了DRG感觉神经元的电生理异常；发现高兴奋性主要发生在中大直径神经元而非传统认为的伤害性小直径神经元；通过多层次的实验方法（分子、组织学和电生理学）建立了从免疫激活到神经元损伤再到功能改变的完整证据链；并揭示了这种电生理改变可持续至慢性期，即使在免疫细胞浸润消退之后仍然存在，提示短暂的免疫攻击可能引发持久的功能重塑。