骨质疏松症（Osteoporosis， OP）基因表达谱比较研究的学术报告

一、 研究作者、机构、发表期刊与时间

本研究由来自中国福建省的多个研究机构合作完成。主要作者包括谢丽华（第一作者，单位：福建省中医药科学院骨质疏松症证基因组学重点研究实验室）、冯尔有（并列第一作者，单位：福州市第二医院关节外科）、李胜强（福建省中医药科学院）、柴浩（福建中医药大学）、陈娟（福建省中医药科学院）、李莉（福建省中医药科学院）以及通讯作者葛继荣（福建省中医药科学院骨质疏松症证基因组学重点研究实验室）。该研究成果以题为《Comparisons of gene expression between peripheral blood mononuclear cells and bone tissue in osteoporosis》的论文形式，于2023年发表在学术期刊《Medicine》的第102卷第20期。

二、 研究背景与目标

本研究属于骨骼生物学与转化医学领域的交叉研究，聚焦于骨质疏松症（OP）这一全球性重大公共卫生问题。骨质疏松症以骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加为特征，导致骨折风险显著上升，给患者、家庭及社会带来沉重负担。其核心病理机制是骨重塑失衡，即破骨细胞的骨吸收活动超过了成骨细胞的骨形成活动。

研究背景基于以下几点科学认知：首先，外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells， PBMCs），特别是其中的单核细胞，与骨代谢密切相关。它们不仅是破骨细胞的前体细胞，还能分泌多种影响骨代谢的细胞因子（如肿瘤坏死因子TNF、白细胞介素等），因此常被用作探索OP发病机制的替代材料。其次，骨组织本身是OP最直接的病变部位，包含了成骨细胞、破骨细胞、骨细胞等所有相关细胞类型，是研究OP分子机制的理想材料。然而，既往研究大多单独分析PBMCs或骨组织，对于这两种在OP病理生理中均扮演关键角色的组织，其基因表达谱之间的相似性与差异性尚缺乏系统的比较研究。这种比较对于全面理解OP的系统性病理机制、寻找更可靠的诊断生物标志物（Biomarker）至关重要。

因此，本研究的主要目标是：比较OP患者与健康对照者（Normal Controls， NC）的PBMCs和骨组织之间的基因表达谱异同；识别在这两种组织中共同或特异性变化的差异表达基因（Differentially Expressed Genes， DEGs）；并通过生物信息学分析，进一步发掘与OP相关的潜在关键基因、转录因子（Transcription Factors， TFs）和枢纽蛋白（Hub Proteins），以增进对OP发病机制的理解，并为未来诊断和治疗提供新线索。

三、 详细研究流程与方法

本研究遵循了从样本采集、高通量检测到多层次生物信息学分析与实验验证的标准化流程。

1. 研究对象与样本采集：

   • 研究共纳入两组研究对象。第一组来自福建省中医药科学院骨质疏松专科，包括7名原发性OP女性患者和3名健康女性对照，年龄52-68岁。第二组来自福州市第二医院拟行髋关节置换术的患者，包括12名原发性OP女性患者和3名健康女性对照，年龄52-68岁。所有参与者均签署知情同意书，研究方案经福建省中医药科学院中医临床研究伦理委员会批准。
   • 样本处理： 从OP患者（主要来自髋关节置换组）术中采集约1克股骨组织，立即液氮冷冻保存。同时，从所有研究对象（包括患者和对照）空腹采集5毫升外周血。采用淋巴细胞裂解法从外周血中分离PBMCs。两种组织样本均用于后续的RNA提取。

2. 基因表达谱芯片检测与数据获取：

   • 分别使用Trizol试剂从PBMCs和研磨成粉的骨组织中提取总RNA，并进行质控。所有RNA样本送至上海康成生物工程有限公司进行全基因组表达芯片（Agilent whole-genome oligo microarray）分析。
   • 实验步骤： 使用Quick Amp Labeling Kit对RNA进行扩增和标记，与芯片杂交。杂交后洗片，使用Axon GenePix 4000B扫描仪扫描，通过Agilent Feature Extraction软件提取原始数据，并导入Agilent GeneSpring GX软件进行标准化处理（主要采用中位数标准化法）。所有原始数据已上传至GEO数据库，编号为GSE56116和GSE230665。

3. 差异表达基因（DEGs）鉴定：

   • 使用R语言中的limma软件包对芯片数据进行统计分析，以识别OP组与NC组之间的DEGs。设定的筛选阈值是：表达倍数变化（Fold Change）> 2.0 且 p值 < 0.05。此步骤是后续所有分析的基础。

4. 生物信息学功能富集分析：

   • 分别对PBMCs和骨组织中鉴定出的DEGs集合进行功能注释。使用在线数据库DAVID进行基因本体论（Gene Ontology， GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）通路富集分析，以揭示这些基因主要参与的生物学过程、分子功能、细胞组分以及信号通路。分析阈值设为p < 0.05。此步骤旨在从功能层面理解两种组织中基因表达变化的生物学意义。

5. 蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction， PPI）网络构建与枢纽蛋白识别：

   • 基于功能富集分析的结果，研究人员选取了在PBMCs和骨组织中共同富集的90条通路，并提取了参与这些通路的所有DEGs（共352个）。
   • 使用STRING在线数据库（设定置信度得分>0.9）预测这些基因编码蛋白质之间的相互作用关系。将得到的PPI网络数据导入Cytoscape软件进行可视化。在Cytoscape中计算网络中每个节点的“度”（Degree），即连接数。将连接度大于25的节点定义为“枢纽蛋白”（Hub Proteins）。此分析旨在从系统层面找出处于调控网络中心位置的关键蛋白。

6. 转录因子-差异表达基因（TF-DEGs）调控网络构建：

   • 首先，从352个基因中，根据已有PubMed文献筛选出40个已知与OP相关的基因。
   • 使用Enrichr软件预测这40个基因可能受哪些转录因子（TFs）调控。将预测得到的TFs与352个DEGs列表进行比较，得到共同的TFs（即既是预测的调控因子，自身也是差异表达基因）。
   • 利用Cytoscape软件构建TF与靶基因之间的调控网络图，识别出在OP中可能起关键调控作用的转录因子。

7. 实验验证：

   • 为了验证基因芯片结果的可靠性，研究随机选择了4个在两种组织中共同上调的DEGs（RNF215, SULT1B1, ALCAM, KRAS），使用实时定量逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction， RT-PCR）技术在独立的PBMCs样本（3例OP，3例NC）中进行表达水平检测。以GAPDH作为内参基因，采用相对定量（δδCq）法计算基因表达量，并与芯片结果进行比较。

四、 主要研究结果

1. 差异表达基因的鉴定与比较：

   • 芯片分析结果显示，在PBMCs中，OP患者与健康对照相比，共鉴定出226个DEGs。而在骨组织中，鉴定出的DEGs数量高达2295个。这直观表明，与PBMCs相比，骨组织在OP状态下发生了更为广泛的基因表达改变。
   • 将两组DEGs进行比较，发现了14个重叠基因。其中，DUSP22基因在两种组织中的表达趋势不一致（在PBMCs中上调，在骨组织中下调），因此最终确定了13个在两种组织中表达趋势一致（均为上调）的共同DEGs。这13个基因（如RNF215、ALCAM、KRAS等）可能代表了不受组织类型限制、在OP系统病理中稳定变化的潜在核心基因。值得注意的是，除了ALCAM（CD166）外，其余12个基因此前均未报道与OP或成骨作用直接相关。

2. 功能富集分析揭示组织特异性与共性：

   • GO分析： PBMCs中的DEGs显著富集于免疫相关过程，如“T细胞激活的调节”、“适应性免疫反应”、“白细胞介导的免疫”等。这与单核细胞作为免疫细胞的属性相符，提示免疫系统通过PBMCs（特别是其中的单核/巨噬细胞系）深度参与了OP的骨代谢调控。相反，骨组织中的DEGs则显著富集于“尿素跨膜运输”、“肾素分泌”、“肾对血流的反应”等与肾脏功能相关的条目。这从分子层面印证了中医“肾主骨”理论的现代生物学基础，即肾脏在调节钙磷代谢、维生素D活化等方面直接影响骨骼健康。
   • KEGG通路分析： PBMCs中的DEGs富集于“细胞粘附分子”、“哮喘”、“同种异体移植排斥”等免疫相关通路。骨组织中的DEGs除了也富集于“哮喘”、“同种异体移植排斥”等通路外，还特异性富集于“ECM-受体相互作用”、“肾素-血管紧张素系统”等通路。
   • 通路重叠分析： 一个关键的发现是，在PBMCs中鉴定出的几乎全部通路都与骨组织中的通路存在重叠，共发现了90条共同通路。这说明尽管两种组织的基因表达变化在具体功能倾向上有差异（PBMCs偏免疫，骨组织偏肾脏/代谢），但它们所激活或抑制的下游信号通路网络存在高度的一致性，指向了共同的病理生理核心机制。

3. PPI网络识别出枢纽蛋白：

   • 基于90条共同通路相关的352个DEGs构建的PPI网络，包含225个节点和1820个相互作用。通过计算节点连接度，识别出6个连接度最高（>25）的枢纽蛋白：PI3K1（磷酸肌醇3-激酶调节亚基1）、APP（淀粉样前体蛋白）、GNB5（G蛋白亚基β5）、FPR2（甲酰肽受体2）、GNG13（G蛋白亚基γ13）和PLCG1（磷脂酶C γ1）。
   • 结果解读： 这些枢纽蛋白在相互作用的网络中处于中心位置，意味着它们可能对OP相关的分子网络状态具有重要影响。其中，APP已有大量研究证实与低骨密度和OP相关。PI3K1、FPR2和PLCG1也已有间接证据提示可能参与成骨或破骨过程。而GNB5和GNG13则是首次在此研究中被提示可能与OP相关，为后续研究提供了全新的潜在靶点。

4. TF-DEGs调控网络识别出关键转录因子：

   • 构建的调控网络显示，有12个转录因子（TFs）预测调控35个OP相关DEGs的表达。
   • 在这12个TFs中，有5个（CREB1、RUNX1、STAT3、CREBBP、GLI1）自身也是差异表达基因，即它们可能在OP中既受到上游调控，又作为调控者影响下游基因的表达。因此，这5个TFs被确定为关键转录因子。文献调研证实，这些转录因子均在骨代谢（成骨分化、破骨形成、骨折愈合等）中发挥重要作用。例如，CREB1通过cAMP-PKA-CREB通路促进成骨；RUNX1是造血和骨代谢的关键调控因子，能负向调节破骨细胞形成；STAT3可促进成骨分化并抑制破骨分化；CREBBP（即CBP）作为共激活因子促进成骨相关基因转录；GLI1是Hedgehog信号通路的关键效应因子，对成骨细胞增殖分化至关重要。

5. 实验验证结果：

   • RT-PCR验证显示，随机选取的4个共同DEGs（RNF215, SULT1B1, ALCAM, KRAS）在PBMCs中的表达趋势与基因芯片分析结果完全一致，从而证实了本研究高通量数据的可靠性。

五、 研究结论与价值

本研究通过系统比较OP患者PBMCs和骨组织的基因表达谱，深化了对OP发病分子机制的理解，并提出了多个具有潜在价值的生物标志物和治疗靶点。

1. 结论：

   • PBMCs和骨组织在OP中展现出既相互联系又各有侧重的基因表达特征。PBMCs更侧重于免疫应答，而骨组织更侧重于肾脏相关反应和物质转运。然而，两者激活的信号通路网络高度重叠，指向共同的病理核心。
   • 与PBMCs相比，骨组织能更全面、更直接地反映OP的分子改变，是研究OP机制的理想材料，尽管其获取难度较大。
   • 研究识别出13个两种组织共有的DEGs、6个PPI网络枢纽蛋白（PI3K1, APP, GNB5, FPR2, GNG13, PLCG1）以及5个关键转录因子（CREB1, RUNX1, STAT3, CREBBP, GLI1）。其中，ALCAM、PI3K1、FPR2、PLCG1、GNB5、GNG13等基因被提示为OP的潜在新型生物标志物或治疗干预靶点。

2. 价值：

   • 科学价值： 首次在系统水平上平行比较了PBMCs和骨组织在OP中的转录组特征，揭示了两种组织在OP分子网络中的不同角色和内在联系，为“免疫-骨骼轴”和“肾-骨轴”的交互作用提供了新的基因组学证据。
   • 应用价值： 发现的共同DEGs、枢纽蛋白和关键转录因子，为开发基于血液（PBMCs）或骨组织的OP诊断生物标志物 panel 提供了候选分子库。新提出的靶点如GNB5、GNG13等，为开发新型抗骨质疏松药物指明了潜在方向。

六、 研究亮点

1. 研究视角新颖： 打破了单一组织研究的局限，首次对OP中两个关键但性质迥异的组织（易于获取的外周血PBMCs和病变核心的骨组织）进行了平行、系统的转录组比较研究，视角独特，信息量大。
2. 多层次整合分析： 不仅进行了常规的差异基因分析和功能富集，还进一步整合了PPI网络分析、转录因子调控网络分析，从基因列表、功能通路、蛋白互作网络到转录调控层面，层层递进，深入挖掘数据，得出了更系统、更有深度的结论。
3. 发现新的潜在靶点： 识别出的枢纽蛋白GNB5和GNG13，以及关键转录因子如GLI1等，在既往OP研究中关注较少或未被明确关联，是本研究的创新性发现，拓展了OP研究的基因图谱。
4. 基础与临床结合： 研究样本直接来源于临床患者，分析结果紧密结合已有文献进行生物学意义阐释，并进行了初步的实验验证，体现了转化医学的研究思路。

七、 其他有价值的内容

研究也坦诚地指出了自身的局限性，主要包括：PBMCs和骨组织样本并非来自同一批个体；样本量相对有限；研究人群存在地域局限性。这些不足为未来开展更大规模、多中心、配对样本（同一患者的血液和骨组织）的研究指明了方向，同时也提示读者在解读和推广本研究发现时需保持谨慎。