学术研究报告：基于病毒样颗粒的可编程CRISPR-Cas9核糖核蛋白递送系统（RIDE）在眼新生血管及亨廷顿病基因治疗中的应用

作者与发表信息

本研究由Sikai Ling、Xue Zhang、Yao Dai、Zhuofan Jiang等13位共同第一作者合作完成，通讯作者为Jiaxu Hong（复旦大学附属眼耳鼻喉科医院）和Yujia Cai（上海交通大学系统生物医学研究院）。团队来自上海交通大学、复旦大学、瑞典卡罗林斯卡医学院、阿斯利康研发中心等机构。论文于2024年12月17日在线发表于Nature Nanotechnology（DOI: 10.1038/s41565-024-01851-7）。

学术背景

研究领域：本研究属于基因编辑与纳米递送技术的交叉领域，聚焦CRISPR-Cas9的靶向递送问题。
科学问题：尽管CRISPR技术在体内基因治疗中潜力巨大，但现有递送工具（如腺相关病毒AAV、脂质纳米颗粒LNP）存在细胞靶向性不足、免疫原性高、编辑持续时间不可控等缺陷。例如，超过50%人群存在针对Cas9的中和抗体，且长期表达的Cas9可能引发细胞毒性。
研究目标：开发一种可编程细胞趋向性的CRISPR-Cas9核糖核蛋白（Ribonucleoprotein, RNP）递送系统（RIDE），实现瞬时、细胞特异性的基因编辑，并在眼新生血管和亨廷顿病（Huntington’s disease, HD）模型中验证其疗效与安全性。

研究流程与方法

1. RIDE系统的构建与表征

• 设计原理：
  
  • 通过改造慢病毒载体（Lentiviral vector, LV）的Gag蛋白，插入MS2衣壳蛋白结合位点，使其与携带MS2茎环结构的gRNA结合，从而将预组装的Cas9-gRNA RNP包装进病毒样颗粒（Virus-like particle, VLP）。
    
  • 创新点：利用MS2-gRNA的特异性结合实现Cas9的高效包裹，避免DNA载体长期表达的免疫风险。
    
• 实验验证：
  
  • Western blot和免疫共定位证实Cas9与VLP标志蛋白p24共定位于293T细胞内，且Cas9在72小时后降解，符合瞬时编辑特性。
    
  • 电镜观察显示RIDE结构与传统LV相似，粒径均一（约200 nm）。
    
  • 编辑效率对比：RIDE在多种细胞系（如293T、SH-SY5Y）中的编辑效率与AAV和LV相当，显著高于LNP（如AAVS1位点编辑效率达38%）。
    

2. 眼新生血管疾病模型治疗

• 靶点选择：视网膜色素上皮（RPE）细胞高表达VEGFA（血管内皮生长因子A），是病理性血管生成的关键介质。
  
• 递送策略：利用VSV-G假型RIDE的天然RPE趋向性，通过视网膜下注射递送VEGFA靶向gRNA。
  
• 结果：
  
  • 基因编辑：RPE中VEGFA位点插入缺失（indel）频率达38%，且未检测到脱靶效应。
    
  • 表型改善：激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）面积减少43%，VEGFA蛋白水平下降60%。
    
  • 安全性：单细胞RNA测序（scRNA-seq）发现RIDE组上皮-间质转化（EMT）细胞比例升高（8.28% vs 对照组0%），但长期随访（7个月）未观察到视网膜功能损伤（ERG和OCT检测正常）。
    

3. 亨廷顿病模型治疗

• 靶点设计：针对突变亨廷顿蛋白（HTT）基因的CAG重复区域，设计5对gRNA（G1-G5），筛选出高效组合（G1+G2）。
  
• 神经元靶向递送：
  
  • 开发杂交包膜蛋白HyRV-G（融合狂犬病毒糖蛋白的神经元趋向域），实现纹状体神经元特异性转导。
    
  • 非人灵长类（NHP）验证：纹状体注射后，HTT蛋白表达显著降低，且未引发系统性免疫反应（IL-6和IL-1β轻微升高，肝酶ALT/AST无变化）。
    
• 行为学改善：Q175亨廷顿病模型小鼠经RIDE治疗后，体重增加，网格行走测试（Grid Walk）错误率降低，后肢 clasping评分改善。
  

4. 患者来源神经元验证

• 利用亨廷顿病患者诱导多能干细胞（iPSC）分化的神经元，证实RIDE可高效编辑HTT基因（indel频率39%），且脱靶率极低（345个潜在脱靶位点中仅1个检出0.5%编辑）。
  

主要结论与价值

1. 科学价值：
   
   • 首次实现CRISPR RNP的细胞类型可编程递送，突破合成纳米材料的局限性。
     
   • 揭示VLP递送引发的局部免疫微环境变化（如EMT和免疫细胞浸润），为基因治疗安全性评估提供新维度。
     
2. 应用价值：
   
   • 眼科疾病：RIDE可精准编辑RPE细胞，避免抗VEGF药物的全身副作用。
     
   • 神经退行性疾病：神经元靶向编辑为亨廷顿病等提供潜在治愈策略。
     
3. 技术普适性：RIDE平台可通过更换包膜蛋白（如CD3靶向型）扩展至T细胞等系统递送。
   

研究亮点

1. 递送创新：首次将MS2-gRNA与VLP结合，实现RNP的高效包裹和瞬时释放。
   
2. 多模型验证：涵盖小鼠、NHP及患者iPSC衍生神经元，数据链条完整。
   
3. 免疫耐受性：RIDE避免Cas9抗体激活，而传统LV递送会引发强烈IgG反应。
   
4. 临床转化潜力：GMP级生产工艺验证了规模化可行性。
   

其他重要发现

• 单细胞转录组分析：发现基因编辑可能诱导RPE细胞状态转变（如EMT），提示需关注编辑的长期细胞命运影响。
  
• 比较研究：RIDE在NHP中的安全性优于LNP，且编辑效率更高，支持其作为下一代递送工具的潜力。
  

（全文约2000字）