本文报告了一项原创性研究成果，由哈尔滨工业大学的Chao Ma、Yehang Dou、Ruiling Li、Lufeng Zhang、Ziqi Zhou、Silin Guo、Ruipeng Wang、Kanzhi Tao、Yitong Liu以及Xin Yang*（通讯作者）共同完成。研究团队横跨哈工大的医学与健康学院、化工与化学学院、航天学院、未来技术学院、仪器科学与工程学院以及材料科学与工程学院，并有山东利人糖生物学有限公司的参与。该研究于2024年9月16日在线发表于学术期刊 *International Journal of Biological Macromolecules*，卷280，文章编号135735。
本研究属于生物材料与高分子科学交叉领域，具体聚焦于用于伤口修复的医用生物高分子水凝胶的设计与开发。
理想的组织工程支架和伤口敷料应能模仿天然组织，具备高含水量、优异的力学性能和良好的生物相容性。水凝胶因其类似细胞外基质的结构和良好的亲水性，在生物医学领域（如药物递送、伤口敷料）具有广泛应用前景。由天然多糖（如壳聚糖及其衍生物）构建的水凝胶通常具有良好的生物相容性和生物降解性，但普遍面临机械强度低、易溶胀破坏等局限，限制了其应用。另一方面，合成聚合物（如聚丙烯酰胺，PAM）水凝胶具有可设计的结构和较高的凝胶强度，但生物相容性和生物活性可能不足。
为克服单一网络水凝胶的局限性，研究人员提出了双网络（Double Network, DN）水凝胶的策略。这种结构由两个独立的聚合物网络互穿构成，通过非共价相互作用或化学交联结合，可显著提升水凝胶的韧性、强度和能量耗散能力。基于此，本研究旨在利用天然多糖衍生物羧甲基壳聚糖（Carboxymethyl Chitosan， CMCS）与合成聚合物聚丙烯酰胺（Polyacrylamide， PAM），开发一种基于氢键交联的、制备简便的双网络水凝胶（CMCS/PAM DN Hydrogel）。核心目标是解决传统多糖水凝胶力学性能不足的问题，同时保留并融合CMCS的优异生物学特性（如抗菌性、促进细胞迁移）和PAM的良好机械性能，最终获得一种综合性能优异、适用于皮肤修复的伤口敷料候选材料。研究将系统探讨CMCS的引入对水凝胶微观结构、流变学、力学性能、溶胀性、自愈合性、粘附性、生物相容性及体外伤口愈合能力的影响。
本研究包含一个系统的从材料制备、表征到性能评估的完整流程，具体步骤如下：
1. 水凝胶的制备： 研究人员采用“一锅法”热引发聚合制备CMCS/PAM双网络水凝胶。首先，将CMCS溶解于去离子水中，配制不同浓度（1%， 2.5%， 5%， 7.5%， 10%， w/v）的溶液。随后，将丙烯酰胺单体、热引发剂过硫酸铵（APS）和交联剂N, N’-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）溶解于等体积的去离子水中，与CMCS溶液混合，得到预聚体溶液。最后，将混合溶液在80°C下加热，引发丙烯酰胺的自由基聚合反应，形成PAM网络，同时CMCS通过其分子链上的-COOH、-NH₂和-OH基团与PAM网络中的酰胺基团形成广泛的氢键相互作用，从而构建第二重物理交联网络。整个制备过程无需复杂的化学修饰，简便易行。
2. 结构与化学表征： 研究采用了多种技术对所得水凝胶进行表征： * 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析：用于证实CMCS与PAM之间氢键的形成。通过对比纯CMCS和CMCS/PAM水凝胶的红外光谱，观察特征峰（如氨基和羰基的伸缩振动峰）的偏移，以推断分子间相互作用。 * 热重分析（TGA）与差示扫描量热法（DSC）：评估水凝胶的热稳定性以及内部水分的存在状态。DSC用于分析水凝胶的相变和分解温度，以间接反映交联网络的密度。 * 分子动力学模拟：使用Materials Studio 2019软件模拟CMCS与PAM分子间的相互作用。构建CMCS（聚合度设为4）和PAM（聚合度设为4）的分子模型，在周期性盒子中按实验投料比加入水分子，经过几何优化、退火处理，最后在298K下进行5 ns的NVT系统动力学模拟。通过分析氢键数量和键长，从理论层面证实分子间氢键的形成及其网络构建能力。 * 扫描电子显微镜（SEM）观察：对冻干的水凝胶样品进行微观形貌分析，观察其多孔结构。使用Image J软件量化不同CMCS含量水凝胶的孔径，研究CMCS含量对水凝胶微观结构的影响。 * 凝胶含量测试：将水凝胶浸泡于蒸馏水中48小时以去除未反应的单体，然后冻干、浸泡溶胀、再干燥，通过溶胀前后干重计算凝胶含量，评估化学交联效率。
3. 物理与力学性能评估： * 流变学测试：使用流变仪在室温下测量不同CMCS含量水凝胶的储能模量（G‘） 和损耗模量（G’’）。首先通过应变扫描确定线性粘弹区，然后在固定应变（γ = 1%）下进行频率扫描，评估水凝胶的交联强度、稳定性及凝胶状态行为。 * 力学性能测试： * 拉伸测试：将水凝胶制成哑铃型样品（长28 mm，宽4 mm，厚1.5 mm），使用万能试验机以50 mm/min的速度拉伸直至断裂，记录拉伸强度和断裂伸长率。 * 压缩测试：使用圆柱形水凝胶样品（高50 mm，直径15 mm），以5 mm/min的加载速率压缩至70%应变，计算压缩强度。 * 循环加载-卸载测试：对样品（选择5% CMCS浓度）分别进行拉伸（50%应变）和压缩（50%应变）的循环测试（5个循环），以评估水凝胶的能量耗散能力、弹性恢复和抗疲劳性能。 * 可注射性测试：使用旋转流变仪测量水凝胶粘度随剪切速率的变化，根据其是否表现出剪切稀化行为来判断其是否具备可注射性。 * 粘附性能测试：选择猪皮作为生物组织模型，进行搭接剪切实验，定量测定水凝胶对猪皮的粘附强度。同时，定性观察水凝胶对玻璃、金属、塑料等不同亲水性表面的粘附能力。 * 自愈合性能测试：将圆柱形水凝胶切成两半，然后将断面接触，在室温下放置10分钟观察其自愈合情况。对愈合后的水凝胶进行拉伸测试，通过比较愈合前后的最大拉伸力，计算自愈合效率。 * 溶胀性能测试：将冻干的水凝胶浸泡在不同离子强度（0.05 M， 0.1 M， 0.2 M）和不同pH值（pH 3-11）的PBS溶液中，定期取出称重，计算溶胀率，研究其在不同生理环境下的溶胀行为。 * 保水性测试：在恒温恒湿条件下，测量水凝胶质量随时间的变化，计算其质量剩余率，评估其抵抗水分蒸发的能力。
4. 生物医学功能与生物相容性评价： * 药物释放测试：以布洛芬为模型药物，制备载药水凝胶。将其浸入PBS溶液中，在持续搅拌下于不同时间点取样，用紫外分光光度计测量溶液在274 nm处的吸光度，计算药物的累积释放率，评估水凝胶的缓释潜力。 * 抗菌活性测试：以大肠杆菌为测试菌种，将灭菌后的水凝胶与稀释的细菌溶液共培养24小时。通过测量培养液在600 nm处的光密度，计算水凝胶的抑菌率。同时以纯PAM水凝胶和壳聚糖水凝胶作为对照组进行比较。 * 血液相容性（溶血）测试：将水凝胶与红细胞悬液共孵育1小时，离心后测量上清液在540 nm处的吸光度，计算溶血率。溶血率低于5%被认为具有良好的血液相容性。 * 细胞生物相容性评估： * MTT法：将水凝胶浸提液与小鼠成纤维细胞L929共培养24小时，通过MTT法测定细胞存活率，评估材料的细胞毒性。 * 活/死细胞染色：使用钙黄绿素-AM（活细胞染色）和碘化丙啶（死细胞染色）对共培养后的L929细胞进行染色，在荧光倒置显微镜下观察并拍照，直观评估细胞活性。 * 体外伤口愈合研究（细胞划痕实验）：在六孔板中培养L929细胞形成单层后，用移液器吸头制造划痕，模拟体外伤口。然后加入水凝胶浸提液继续培养，在0、12、24小时观察并测量划痕宽度，计算相对伤口闭合率，评估水凝胶促进细胞迁移的能力。
5. 数据分析： 所有实验均至少进行三次平行实验，数据以平均值±标准差表示。使用SPSS软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），以p < 0.05作为差异具有统计学意义的判断标准。
本研究通过详尽的实验，系统揭示了CMCS/PAM双网络水凝胶的结构与性能关系，结果如下：
1. 结构与化学表征结果： FT-IR光谱显示，与纯CMCS相比，CMCS/PAM水凝胶中氨基（-NH₂）的伸缩振动峰从3443 cm⁻¹偏移至3421 cm⁻¹，羰基（C=O）的伸缩振动峰从1689 cm⁻¹偏移至1672 cm⁻¹。这表明CMCS与PAM分子链之间形成了氢键相互作用，这是构建物理交联双网络的基础。DSC分析表明，引入CMCS后，水凝胶的分解峰向更高温度移动，表明其热稳定性增强，这归因于氢键交联增加了分子间的相互作用力。SEM图像清晰地展示了CMCS含量对微观结构的显著影响：纯PAM水凝胶呈现不规则纤维状结构；当CMCS含量为5%时，水凝胶形成了均匀、致密的小孔结构（孔径约4.81 ± 0.55 μm，约为纯PAM水凝胶孔径的1/4）；当CMCS含量增至10%时，出现了明显的片层堆叠结构。这说明CMCS的引入改变了PAM网络的微观形态，优化了孔结构。凝胶含量测试结果显示，随着CMCS含量从1%增加到5%，凝胶含量先上升后下降，在5%时达到峰值。这初步表明，适量的CMCS能与PAM通过氢键有效增强网络交联，但过量时可能因CMCS分子链内氢键的优先形成而影响网络间交联。分子动力学模拟结果从原子层面提供了强有力的支持：模拟显示一个CMCS分子可与三个PAM分子结合，形成多达七个分子间氢键（键长均小于2.5 Å），直观地证实了CMCS与PAM之间可通过氢键构建起第二层网络结构。
2. 物理与力学性能结果： 流变学测试表明，所有CMCS/PAM水凝胶的储能模量（G‘）均高于损耗模量（G’’），证实了其凝胶态行为。随着CMCS浓度从1%增加到5%，水凝胶的线性粘弹区临界应变值从110%降至83%，同时G’增加，说明氢键交联作用增强，网络更牢固。但当CMCS浓度达到7.5%时，G‘和G’’开始下降，这与此前凝胶含量下降的趋势一致，暗示分子内氢键的形成可能限制了有效的网络交联。力学测试结果与上述结构表征和流变结果高度吻合。拉伸和压缩测试均显示，随着CMCS含量的增加，水凝胶的强度（拉伸强度和压缩强度）和断裂伸长率均呈现先增后减的趋势，在5% CMCS含量时达到最佳。例如，与纯PAM水凝胶相比，5% CMCS/PAM水凝胶的拉伸强度提高了300%。这一现象的逻辑在于：适量的CMCS通过氢键与PAM网络紧密互穿，形成能量耗散机制。当受到外力时，氢键可优先断裂以耗散能量，从而提升韧性；同时，CMCS本身作为刚性组分提供了额外的支撑。但过量的CMCS会导致分子链过于紧密，限制其运动能力，反而使材料变脆。循环加载-卸载测试证实了该水凝胶优异的能量耗散和抗疲劳性能。在经历五次拉伸或压缩循环后，应力-应变曲线几乎重合，滞回环面积稳定，表明其内部动态氢键网络在破坏后能够有效重组恢复。可注射性测试显示水凝胶粘度随剪切速率增加而下降，表现出显著的剪切稀化行为，证明其可通过注射器顺利挤出，适用于不规则创面的原位覆盖。粘附性测试显示，CMCS的引入显著提升了水凝胶对猪皮的粘附强度（从5.21 ± 0.27 kPa提升至7.52 ± 0.05 kPa），这归功于CMCS丰富的-COOH、-NH₂和-OH等官能团，能与组织表面形成多种非共价相互作用（主要是氢键）。水凝胶在玻璃、金属、塑料等亲水表面也表现出良好的粘附性。自愈合测试表明，切断的水凝胶断面接触10分钟后可重新连接并能承受一定重量，5% CMCS/PAM水凝胶的自愈合效率超过50%，这完全依赖于动态可逆的氢键作用。溶胀和保水测试显示，该水凝胶在PBS中具有良好的溶胀稳定性，且CMCS的引入显著提升了其保水能力（24小时内水分流失更慢），这得益于CMCS的亲水基团可与水分子形成更强的水合作用。
3. 生物医学功能与生物相容性结果： 药物释放实验表明，载有布洛芬的水凝胶在24小时内释放了约20%的药物，表现出缓慢、可控的释放行为，这归因于双网络结构和强氢键作用对药物的有效包载与缓释。抗菌测试显示，CMCS/PAM水凝胶对大肠杆菌的抑菌率超过50%（对照组壳聚糖水凝胶为80%），证明了其源自CMCS（带正电荷的氨基可破坏带负电的细菌细胞膜）的固有抗菌活性。血液相容性测试显示，水凝胶组的溶血率仅为3.67% ± 0.03%（远低于5%的安全标准），且上清液颜色与阴性对照组（PBS）相近，表明其具有良好的血液相容性。细胞生物相容性评估是本研究的关键亮点。MTT实验表明，即使在高浓度浸提液下，L929细胞的存活率仍保持在90%以上，证明水凝胶无细胞毒性。活/死细胞染色结果进一步证实，与细胞共培养后，视野中活细胞（绿色荧光）占绝大多数，死细胞（红色荧光）极少。体外伤口愈合研究（细胞划痕实验） 提供了最直接的生物功能证据：培养24小时后，与对照组和纯PAM组相比，5% CMCS/PAM水凝胶浸提液处理组的细胞迁移率最高（相对伤口闭合率达59.43 ± 0.36%），显著促进了成纤维细胞的迁移，表明该材料具有促进伤口愈合的巨大潜力。
本研究成功开发了一种基于氢键交联的羧甲基壳聚糖/聚丙烯酰胺（CMCS/PAM）双网络水凝胶。该水凝胶通过简便的“一锅法”热聚合制备，其中CMCS与PAM之间形成的动态氢键是构建第二重物理网络、赋予材料优异综合性能的关键。研究发现，引入5%含量的CMCS可最优地调控水凝胶的微观结构，形成均匀致密的多孔网络，从而使其同时具备高拉伸强度（较纯PAM提升300%）、高韧性、良好的能量耗散与抗疲劳性、可注射性、对多种生物/非生物表面的粘附性、自愈合能力、pH响应性溶胀、优异的保水性、可控的药物释放能力、固有的抗菌活性、卓越的血液相容性和细胞相容性，并能有效促进成纤维细胞的迁移。
本研究的科学价值在于：1）为构建高性能多糖基生物医用材料提供了一种简单、通用的策略，即通过氢键等非共价作用构建双网络结构来协同增强天然高分子与合成高分子的性能；2）从分子动力学模拟到宏观性能测试，系统揭示了CMCS含量对水凝胶结构-性能关系的调控机制，特别是存在一个最佳浓度以实现性能最优化的规律；3）证实了动态氢键网络在赋予水凝胶自愈合、能量耗散等智能特性方面的关键作用。
其应用价值尤为突出：所开发的CMCS/PAM水凝胶集多种理想伤口敷料特性于一身（保湿、抗菌、促愈合、可注射贴合、缓释药物、生物安全），为设计新一代多功能、智能化的皮肤修复材料提供了一个极具潜力的候选方案。该研究将基础材料科学与生物医学应用紧密结合，为后续的动物实验和临床转化奠定了坚实的理论与实验基础。