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关于牙菌斑生物膜微生物群落关联性的研究学术报告

2008年，由Forsyth研究所牙周病学部门的Anne D. Haffajee, Sigmund S. Socransky, Megha R. Patel及Xiaojing Song共同完成的一项研究，在《口腔微生物学与免疫学》（*Oral Microbiology and Immunology*）期刊上发表，题为“龈上菌斑中的微生物复合体”（Microbial complexes in supragingival plaque）。

这项研究的主要作者均来自美国马萨诸塞州波士顿的Forsyth研究所（The Forsyth Institute, Boston, MA, USA）。论文于2008年发表。

学术背景 这项研究属于口腔微生物学与牙周病生态学领域。在1998年，同一研究团队（Socransky等）发表了一篇里程碑式的论文，利用聚类分析（cluster analysis）和群落排序（community ordination）技术，首次系统地描述了龈下（subgingival）菌斑生物膜中不同细菌种类间的特定关联性，并将其归为不同的“微生物复合体”（microbial complexes），例如，由牙龈卟啉单胞菌（*Porphyromonas gingivalis*）、福赛斯坦纳菌（*Tannerella forsythia*）和齿垢密螺旋体（*Treponema denticola*）组成的“红色复合体”（red complex）被广泛认为与牙周疾病高度相关。这一模型极大地简化了对龈下菌群与牙周健康或疾病状态之间关系的理解。

然而，在1998年，由于样本数量不足，团队未能对龈上（supragingival）菌斑进行类似的分析。龈上和龈下菌斑在微环境、宿主防御机制和营养来源上存在差异，其微生物群落结构可能不同。鉴于龈上菌斑是牙周病的始动因素，也是许多口腔疾病的基础，了解其成熟的微生物群落结构，以及这些群落在受到干扰（如专业清洁）后的动态变化，对于理解口腔生态学和疾病预防至关重要。

因此，本研究的主要目的是利用与1998年研究相同的分析方法，即聚类分析和群落排序技术，来系统地检测和分析龈上菌斑样本中40种细菌物种之间的关联性，识别其中是否存在稳定的微生物复合体，并探讨这些复合体与临床牙周状态（如牙龈炎症、探诊深度和附着丧失）之间的关系。此外，研究还比较了“成熟”菌斑、专业清洁后短期（1-7天）再形成的菌斑以及牙周治疗后长期（3-24个月）再形成的菌斑，以了解群落结构的稳定性与动态变化。

详细工作流程 本研究设计严谨，流程清晰，主要包括以下几个关键步骤：

1. 研究对象与样本收集：研究共纳入了187名年龄在22至74岁之间的受试者。这些受试者被分为两组：38名牙周健康者和149名有既往附着丧失证据（即慢性牙周炎患者）。所有受试者在研究前至少3个月未接受牙周治疗或使用抗生素。

   • 基线样本（成熟菌斑）：所有187名受试者在任何专业口腔卫生操作前，从除第三磨牙外的每颗牙齿的近中面，使用单独的Gracey刮治器采集了龈上菌斑样本，共计4745个样本。这些样本代表“成熟”状态，菌斑年龄未知。
   • 短期再形成样本：其中55名受试者（38名健康者，17名患者）在接受彻底的专业洁牙后，被要求停止家庭口腔护理，并在洁牙后第1、2、4、7天再次采集全口龈上菌斑样本，共计1456个样本。
   • 长期再形成样本：另一组132名慢性牙周炎患者接受了不同的牙周治疗（包括龈下刮治和根面平整，伴或不伴有辅助药物治疗）。其中93名受试者在治疗后3至24个月的复诊期间（总计325次复诊），在维护治疗前提供了龈上菌斑样本，共计8044个样本。

   所有样本采集后立即置于含Tris-EDTA缓冲液的离心管中，并加入NaOH进行裂解，以备后续分析。

2. 微生物学评估：采用一种成熟且标准化的“棋盘格DNA-DNA杂交”（checkerboard DNA-DNA hybridization）技术，对每个菌斑样本进行40种细菌物种的定性和半定量检测。具体流程如下：

   • 样本裂解后，将DNA加样到尼龙膜上形成条带。
   • 将膜置于微型槽式印迹仪（miniblotter）中，使样本DNA条带与设备中平行的探针槽垂直。
   • 将40种细菌的全基因组DNA探针（用地高辛标记）分别加入独立的探针槽中，与膜上的目标DNA进行杂交。
   • 高严格度洗膜后，使用与碱性磷酸酶偶联的抗地高辛抗体进行检测，并通过化学荧光底物显色。
   • 使用荧光成像仪读取杂交信号强度，并参照膜上已知浓度的标准品（每种细菌10^5和10^6细胞）将信号强度转换为细菌绝对数量。该方法的检测灵敏度可调节至每个样本能检测到10^4个目标细菌细胞。

3. 数据分析方法：研究采用多层次的数据分析方法来揭示物种间的关联性。

   • 相似性系数计算：对于每一对物种（共780对），根据样本中该物种的数量（或根据预设阈值，如>10^5，转换为存在/不存在数据），计算了9种不同的相似性系数，包括Bray Curtis、Chord、Gower、Canberra、Sørensen、欧几里得距离、马氏距离D^2以及基于存在/缺失数据的Phi系数。这确保了分析结果的稳健性，不依赖于单一的相似性度量标准。
   • 聚类分析：使用平均未加权连锁排序法（average unweighted linkage sort）对计算出的9组相似性矩阵分别进行聚类分析，生成9个独立的树状图，以可视化展示物种间的分组（复合体）关系。
   • 群落排序：为了在二维或三维空间中直观展示所有物种间的整体关联模式，研究采用了主成分分析（principal components analysis）和对应分析（correspondence analysis）。这两种多元统计方法能够将高维数据（40个物种在所有样本中的丰度）降维，使得经常共存的物种在生成的图表中位置接近。
   • 综合判断：研究人员综合了上述9个聚类树状图和两种排序分析的结果，通过共识判断，绘制出代表“成熟”菌斑和“长期再形成”菌斑中微生物复合体及其相互关系的示意图（即文中的图1和图4）。
   • 与临床参数关联分析：为了探究微生物复合体与牙周临床状态的关系，研究将样本数据根据临床特征（如是否探诊出血、是否有牙龈红肿、探诊深度、附着水平、有无牙龈退缩）进行分类。然后计算并比较各类别中各个物种的平均数量。统计显著性差异采用方差分析（ANOVA）进行检验，并对40次比较（对应40个物种）进行了多重比较校正。

主要研究结果 本研究的核心发现是，在龈上菌斑中同样存在与龈下菌斑类似但又不完全相同的、特定的微生物复合体，且这些群落结构在长期稳定的菌斑中相对固定，但在短期扰动后会发生显著变化。

1. 成熟龈上菌斑中的微生物复合体：对187名受试者的4745个基线样本分析后，确定了6个主要的微生物复合体（图1）。这些复合体与龈下菌斑的发现既有继承又有区别：

   • 红色复合体：与龈下菌斑高度一致，核心成员仍是P. gingivalis, T. forsythia 和 *T. denticola*。此外，*Eubacterium nodatum*也被紧密关联在该复合体内，*Treponema socranskii*则与之存在松散关联。
   • 橙色复合体：包含了龈下研究中的许多成员，如Campylobacter showae, C. rectus, 多种梭杆菌亚种（Fusobacterium nucleatum subspecies）、Prevotella intermedia, *P. nigrescens*等，并加入了Gemella morbillorum, Capnocytophaga ochracea, Selenomonas noxia 和 *Prevotella melaninogenica*。值得注意的是，橙色复合体内部存在明显的亚组。
   • 黄色复合体：主要由链球菌属（*Streptococcus*）构成，如S. mitis, S. oralis, S. gordonii, *S. sanguinis*，以及*S. anginosus*群。此外还包括Leptotrichia buccalis, *Propionibacterium acnes*等。
   • 放线菌复合体：由几种放线菌（Actinomyces spp.）形成紧密的集群。
   • 绿色复合体：包括Capnocytophaga sputigena, Eikenella corrodens 和 *C. gingivalis*。
   • 紫色复合体：一个相对松散的组合，包含Neisseria mucosa 和 *Veillonella parvula*。 聚类分析和群落排序结果均一致地支持这些复合体的存在（图2，图3）。

2. 长期再形成龈上菌斑的群落结构：对93名患者在治疗完成后3-24个月期间采集的8044个样本进行分析（图4，图5），结果显示形成的微生物复合体与“成熟”菌斑中的结构高度相似。主要变化包括：*Gemella morbillorum*和*Leptotrichia buccalis*加入橙色复合体；*P. melaninogenica*转而与红色复合体松散关联；紫色复合体（*N. mucosa*和*V. parvula*）与绿色复合体整合。这表明在治疗后较长时间内，龈上菌斑的微生物群落结构能够“重建”到与治疗前相似的稳定状态，尽管菌斑总量可能减少。

3. 短期再形成龈上菌斑的群落结构：对55名受试者洁牙后1-7天内的1456个样本分析显示（图6，图7），菌斑群落结构发生了显著变化。虽然绿色复合体和某些物种对（如*S. mitis*和*S. oralis*）的关系保持相对稳定，但原本紧密的放线菌复合体和黄色复合体被“打散”，而橙色和红色复合体则与其他复合体的物种相互混杂。这证实了专业清洁作为一种“干扰性”干预，能显著打乱成熟的微生物群落结构，并且7天的时间不足以让龈上菌斑完全恢复到“顶峰群落”（climax community）状态。这种变化可能与不同物种的定殖速度差异有关，例如链球菌（黄色复合体）在清洁后早期迅速回归，而放线菌和红色复合体物种的回归则较慢。

4. 微生物种类与临床参数的关系：

   • 与炎症的关系：分析发现，所有40种检测细菌的平均数量在探诊出血或牙龈红肿的位点都更高（图8）。但具有统计学显著差异的主要是橙色和红色复合体中的物种。例如，S. noxia, C. gracilis, P. nigrescens, C. rectus, *C. showae*等在红肿位点显著增多。而*S. sanguinis*在不出血的位点比例更高。
   • 与牙周破坏的关系：龈上菌斑中橙色和红色复合体物种的数量，与邻近牙周袋的深度和附着丧失程度呈正相关（图9）。即使在排除了炎症（牙龈红肿）因素的位点，这种关系依然存在，尤其是在深袋位点，*P. gingivalis*的数量显著更高。这表明深层牙周袋不仅本身藏匿更多这些细菌，还可能通过提供龈沟液（营养物质）和细菌来源，影响邻近龈上菌斑的组成。
   • 与牙龈退缩的关系：相比无牙龈退缩的位点，有牙龈退缩的位点采集的龈上菌斑中，所有物种的平均数量都更高，其中绿色复合体的*E. corrodens*、*C. ochracea*和*C. gingivalis*差异尤为显著。这可能与采样面积增大或这些细菌对牙骨质/牙本质表面有偏好性附着有关。

结论与研究价值 本研究的结论是：龈上菌斑中存在与龈下菌斑相似的、特定的微生物复合体，但存在一些细微差异。这些复合体不仅受细菌间共聚集、选择性附着等因素影响，也受到邻近牙周组织临床状态（如炎症、牙周袋深度）的影响。后者可能通过提供种间结合分子和营养物质来“富集”特定的群落。临床治疗会暂时打乱这种群落结构，但随着时间的推移（3-24个月），基本的群落结构能够重新建立。

研究的科学价值与应用价值： * 科学价值：这是首次系统性地运用多变量分析方法大规模描述龈上菌斑微生物群落结构的研究。它将龈下微生物生态学的“复合体”概念成功拓展到龈上环境，加深了我们对口腔生物膜作为一个复杂、结构化生态系统的理解。研究揭示了菌斑群落从扰动到重建的动态过程，以及宿主临床状态与龈上菌斑组成的双向相互作用。 * 应用价值：研究结果支持了龈上菌斑控制对牙周健康的重要性。深层牙周袋会影响龈上菌斑的致病性组成，这提示彻底的牙周治疗（减少牙周袋深度和炎症）不仅有益于龈下环境，也能间接改善龈上菌斑的微生物构成。同时，研究也指出短期（如7天）的菌斑控制可能不足以完全破坏致病菌复合体，强调了长期、持续口腔卫生维护的必要性。这些复合体图谱为进一步研究物种间的生态关系、与宿主的相互作用以及开发针对特定复合体的新型干预策略（如益生菌、靶向抗菌剂）提供了基础。

研究亮点 1. 研究对象的创新：首次大规模、系统性地将已在龈下菌斑研究中取得成功的“微生物复合体”分析模型，应用于龈上菌斑。 2. 研究设计的全面性：不仅分析了静态的“成熟”菌斑，还纳入了“短期再形成”和“长期再形成”的动态过程，完整揭示了菌斑群落受到干扰后的重建轨迹，这是对口腔生物膜生态动力学研究的重要贡献。 3. 样本量和分析方法的稳健性：基于超过14，000个龈上菌斑样本进行分析，数据量巨大。同时，采用9种不同的相似性系数和2种群落排序方法进行交叉验证，确保了所发现复合体的可靠性和稳健性。 4. 与临床的紧密结合：研究不仅描述了微生物群落，还深入分析了这些群落与探诊出血、牙龈红肿、牙周袋深度、附着丧失、牙龈退缩等多个临床参数的关联，将微生物生态学发现与临床表型直接联系起来，具有很高的临床指导意义。 5. 揭示了宿主环境对龈上菌斑的影响：研究发现深层牙周袋和附着丧失会影响邻近龈上菌斑的组成，这表明龈上和龈下环境并非孤立，而是存在物质和微生物的“交流”，深化了对牙周病微生态系统的整体认识。

其他有价值内容 研究还探讨了不同物种回归速度的差异对群落结构动态变化的影响。例如，链球菌（黄色复合体）回归最快，而放线菌和红色复合体回归较慢，这为理解菌斑成熟序列提供了参考。此外，作者坦率地讨论了研究的局限性，例如图表是对多维关系的简化二维/三维呈现，可能存在人为解读误差；以及短期和长期研究阶段的受试者群体不完全一致等，体现了研究的严谨性。最后，文章提出了未来可以比较同一牙齿上附着于牙釉质和牙根表面的菌斑成分差异，指明了进一步研究的方向。