工程化大规模hiPSC衍生的血管集成肌肉样晶格用于增强体积性肌肉再生

一、 主要作者、机构与发表信息 本研究由Myung Chul Lee、Yasamin A. Jodat（共同第一作者）等来自美国布莱根妇女医院/哈佛医学院、韩国科学技术院、清华大学、巴黎大学、康涅狄格大学健康中心、内布拉斯加大学、加州大学伯克利分校、首尔国立大学等多个研究机构的合作团队共同完成。通讯作者为Woo-Jin Kim、Indranil Sinha和Su Ryon Shin。该研究以题为“Engineering large-scale hiPSC-derived vessel-integrated muscle-like lattices for enhanced volumetric muscle regeneration”的论文形式，于2024年12月发表在《Trends in Biotechnology》期刊上（卷42，期12，页码1715–1744）。

二、 学术背景与研究目的 本研究的科学领域为组织工程与再生医学，具体聚焦于骨骼肌的修复与再生。体积性肌肉损失（Volumetric Muscle Loss, VML）通常由大面积创伤引起，涉及骨骼肌的完全丧失，其自然修复能力有限，常导致广泛纤维化，是临床上的重大挑战。现有的治疗方法，如干细胞注射、生长因子递送、生物材料植入或工程化肌肉组织移植，在促进功能性肌肉再生方面效果有限。人类诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）因其强大的增殖潜力和分化为肌源性细胞的能力，为VML治疗提供了极具前景的细胞来源。然而，构建具有临床相关性的大尺寸hiPSC衍生肌肉植入物面临多重挑战：需要模拟骨骼肌复杂的层次化结构（包括排列整齐的肌纤维和血管网络）；确保植入物在缺损部位的存活，特别是在植入早期能够获得足够的氧气和营养；以及实现植入物与宿主组织的有效整合，以促进功能性再生。

因此，本研究旨在开发一种创新的生物制造策略，以解决上述挑战。具体目标包括：1）利用先进的生物打印技术，构建大规模、可扩展、预先血管化的hiPSC衍生肌肉样组织；2）在体外验证该组织能够支持hiPSC分化为成熟、排列整齐且具有收缩功能的肌纤维；3）在体内评估该工程化组织在VML损伤模型中的再生能力，包括促进血管生成、减少纤维化、形成神经肌肉连接以及恢复肌肉功能。

三、 详细研究流程与方法 本研究包含一个系统且多步骤的工作流程，涵盖生物墨水与支架材料开发、生物打印工艺优化、体外细胞培养与表征、体内植入与功能评估等多个环节。

1. 生物墨水与支持基质的开发与优化： 研究团队首先开发了一种非常规的嵌入式多材料生物打印（uEMB）方法。该方法的核心在于将含有细胞的生物墨水直接打印到一种预先凝胶化的明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）支持基质中，而不是传统的微凝胶或浆料中。支持基质模拟了天然肌肉的肌内膜结构，为相对柔软的细胞负载通道或中空微通道提供机械支撑，防止结构坍塌。 * 肌肉生物墨水： 由GelMA和明胶组成，富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）结合位点，以促进hiPSC衍生的肌肉祖细胞（hiPSC-MPCs）的粘附、排列和融合。通过调整GelMA浓度和交联密度，优化了水凝胶的孔隙率、降解行为和力学性能（目标刚度10-50 kPa，弹性应变>30%），以创造适合肌源性分化和成熟的微环境。 * 可灌注通道墨水： 使用热可逆的明胶作为牺牲材料，打印后通过升温至37℃将其溶解，从而在支持基质内形成中空的、可灌注的血管样通道网络。 * 打印工艺优化： 利用GelMA和明胶的热可逆凝胶特性，在溶胶-凝胶转变温度（~8°C至~20°C）下进行打印。通过调整墨水流速和喷嘴移动速度，可以精确控制打印通道的直径（160±8至220±16 μm）和间距。使用紫外光（UV）交联将整个结构（支持基质和打印图案）固化为坚固的水凝胶支架。

2. 复杂结构构建与可扩展性验证： 利用uEMB技术，研究团队成功打印了多种复杂的3D结构。 * 高密度排列结构： 在约1 cm³的支持基质内，快速打印出纵向排列的高密度肌肉纤维和血管样晶格图案，模拟天然肌纤维束的结构。 * 分形分支网络： 打印了模拟四种不同类型天然血管化骨骼肌皮瓣结构的复杂分形分支网络，每个结构的打印时间少于5分钟。 * 模块化组装： 为了构建更大尺寸的植入物，开发了模块化策略。使用低浓度（3% w/v）的GelMA预聚体溶液作为光固化“胶水”，将多个厘米尺度的预制模块组装成体积可达10 cm³的复杂、可灌注的3D结构，展示了该技术应对大尺寸缺损的潜力。

3. 体外细胞培养、分化与功能表征： * 细胞来源与培养： 使用了两株hiPSC细胞系（NCRM-1和GM23338），并通过血清游离分化方案将其分化为hiPSC-MPCs。 * 生物打印与3D培养： 将高密度（>20 × 10⁶ 细胞/mL）的hiPSC-MPCs封装在优化的肌肉生物墨水中，并打印到支持基质内。打印后的构建体在分化培养基中培养长达4周。 * 表征方法： * 形态与成熟度： 通过免疫荧光染色（标记物包括Actn2, Pax7, MyoG, Titin, MyHC等）评估肌纤维的形成、排列、肌节组织以及卫星细胞的维持。使用快速傅里叶变换（FFT）分析量化肌纤维排列程度。 * 收缩功能： 通过延时显微成像记录工程化肌纤维的自发性收缩活动。 * 血管化通道功能： 在通道内接种人脐静脉内皮细胞（HUVECs），形成内皮化的血管样网络。通过灌注荧光标记的葡聚糖并利用共聚焦显微镜进行时间序列成像，量化通道的灌注能力和物质扩散渗透性。使用氧敏感探针评估构建体内的氧分布。 * 力学性能： 通过压缩试验评估构建体的杨氏模量，并进行循环加载测试（高达40%应变）以模拟体内肌肉的周期性应力，验证其弹性行为和抗疲劳性。 * 恶劣微环境模拟： 将hiPSC-MPCs负载的水凝胶在缺氧和/或分化试剂耗竭的条件下培养，模拟VML缺损区的恶劣环境，评估细胞存活、死亡或去分化情况。

4. 体内植入与功能评估： 研究进行了皮下植入和VML缺损修复两类体内实验。 * 皮下植入研究（血管化评估）： 在裸鼠皮下植入四种不同设计的GelMA构建体（G1：支持基质中含内皮化的可灌注通道；G2：在负载HUVECs的支持基质中含内皮化的可灌注通道；G3：无细胞的空心通道；G4：负载HUVECs的块状水凝胶）。在植入后1周和3周收获样本，通过H&E染色和免疫组化（CD31）评估宿主血管浸润、移植物-宿主整合以及材料降解情况。 * VML缺损修复研究（功能再生评估）： 使用两种免疫缺陷小鼠模型（NOD-scid IL2Rγammanull和Rag2−/−γc−/−）。 * 手术模型： 在小鼠后肢腓肠肌和比目鱼肌区域创建全层圆柱形肌肉缺损（体积约16π mm³，约占肌肉质量的20%）。 * 植入物准备： 将3D生物打印的构建体（V3组：含hiPSC-MPCs和内皮化血管样晶格的VMLs；V2组：无细胞的生物打印构建体）附着在可缝合的聚癸二酸甘油酯/聚己内酯（PGS/PCL）电纺纳米纤维支架上，以固定植入物并促进整合。 * 实验分组： 分为四组：V3（治疗组）、V2（无细胞对照组）、V1（未治疗缺损组）和V0（假手术组）。 * 评估时间点与指标： * 组织学分析（4周和8周）： 评估纤维化面积、新生肌纤维（MyHC表达、中央核）、血管生成（小鼠和人类CD31共表达）、神经肌肉连接形成（乙酰胆碱受体AChR与βIII-tubulin共表达）以及植入的人源细胞贡献（人类层粘连蛋白A/C, HLA-A, 人特异性Spectrin和Dystrophin共标记）。 * 功能恢复测试（4周和8周）： * 踝关节跖屈扭矩测试： 在体测量肌肉等长收缩的最大扭矩。 * 离体肌肉收缩力测试（8周）： 分离腓肠肌，测量其最大颤搐力和强直收缩力。 * 细胞因子分泌分析： 通过ELISA检测hiPSC衍生VMLs在体外培养过程中血管内皮生长因子（VEGF）的分泌水平。

四、 主要研究结果 1. 成功构建了可扩展、血管集成、含高密度排列hiPSC衍生肌纤维的VMLs： uEMB技术能够快速、高分辨率地打印出包含排列整齐的hiPSC-MPCs微纤维和可灌注血管样通道的复杂结构。打印的肌纤维在分化后形成具有清晰横纹、毫米级长度的三级肌纤维结构，并表现出自发性收缩。内皮化的血管样通道具有良好的开放性和灌注能力，其扩散渗透性与先前报道值相当，且能显著提高支持基质内的氧水平。

2. 血管样晶格显著促进hiPSC衍生肌纤维的成熟： 与不含血管样晶格的构建体相比，集成内皮化血管样晶格的VMLs中，打印的hiPSC-MPCs显示出更高的Pax7、MyHC和MyoG表达水平，肌纤维排列更整齐，融合指数提高约5-10倍，且成人肌肉蛋白（MyoG, MyH1-3, 7, 8）的表达水平显著升高，表明肌纤维的增殖和成熟过程均被加速。

3. 恶劣微环境下证实了血管化的重要性： 在模拟VML缺损的缺氧/营养匮乏条件下，hiPSC-MPCs负载的水凝胶在缺乏有效物质传递时，细胞在7天内发生死亡或去分化。而在常氧/试剂充足的条件下，细胞存活率高，肌纤维融合增加。这强调了在植入物中整合功能性血管网络对于在植入早期维持细胞存活和功能的必要性。

4. 内皮化血管样晶格在体内促进快速血管化和移植物整合： 皮下植入实验表明，含有内皮化通道的构建体（G1， G2）在植入一周后即有红细胞浸润，表明与宿主血管发生了吻合。三周后，宿主毛细血管完全浸润了HUVECs包被的通道，血管密度随时间增加了1.5至2倍。在G2组（支持基质中也封装了HUVECs）中，观察到移植的HUVECs迁移并出芽，与邻近通道连接，并在移植物-宿主界面形成混合（人/鼠）血管，证明了优异的移植物-宿主整合。此外，内皮化通道的存在显著提高了移植构建体中细胞的存活率，并加速了生物材料的降解。

5. hiPSC衍生的VMLs在VML损伤模型中显著增强肌肉再生和功能恢复： * 减少纤维化与促进新生肌纤维： V3治疗组在植入4周后，纤维化面积显著低于未治疗组（V1）和无细胞组（V2）。8周时，V3组残留水凝胶更少，且新生肌纤维（表达MyHC，具有中央核）的数量显著更多。 * 促进血管生成与神经支配： V3组在植入物界面和周围宿主组织中，表达人和小鼠CD31的血管数量显著多于对照组。同时，V3组中宿主神经入侵和神经肌肉接头（AChR与Tuj1共表达）的形成也相对更高。 * 证实人源细胞贡献： 在两种小鼠模型中，均观察到V3组植入区域有明确的人类特异性标记物（HLamin A/C, HSpectrin, HDystrophin）表达，并与肌球蛋白重链（MyHC）共定位，表明新形成的肌纤维部分来源于植入的hiPSC-MPCs。特别是在人源化小鼠（Rag2−/−γc−/−）中，人类CD31+血管的数量显著增加。 * 恢复肌肉功能： 功能测试显示，V3组的踝关节跖屈扭矩响应在4周和8周时均显著高于V1组，并更接近假手术组水平。离体肌肉收缩力测试也证实，V3组的最大颤搐力和强直收缩力均显著高于V1和V2组。 * 旁分泌效应： 体外实验显示，hiPSC衍生的VMLs在分化诱导后的第二至第三周，VEGF分泌量增加了3倍，这可能促进了体内的血管生成、轴突生长和肌肉再生。

五、 研究结论与价值 本研究成功开发并验证了一种基于hiPSC和先进生物打印技术的体积性肌肉损失修复新策略。核心结论是：通过uEMB技术构建的、集成了内皮化血管样晶格的大规模hiPSC衍生肌肉样晶格（VMLs），能够有效模拟天然肌肉的层次化结构，在体外支持hiPSC分化为成熟、排列整齐的肌纤维，在体内能促进快速血管化、增强移植物-宿主整合、减少纤维化、促进神经支配，并最终显著恢复VML损伤后的肌肉结构和功能。

科学价值： 1. 技术创新： 提出了“非常规嵌入式多材料生物打印（uEMB）”方法，实现了在非牺牲性支持基质中直接打印高细胞密度、多材料复杂结构，解决了传统生物打印中干细胞存活与高分辨率难以兼得的矛盾，并为构建厘米级大尺寸组织提供了模块化组装方案。 2. 机制阐释： 明确了工程化血管网络在大型干细胞衍生植入物中的关键作用：不仅为细胞存活提供物质交换通道，还通过促进宿主血管快速浸润和旁分泌因子（如VEGF）的释放，共同创造了有利于再生的微环境。 3. 概念验证： 首次将hiPSC来源的、预先血管化的、厘米尺度的工程化肌肉组织成功应用于VML动物模型，并系统证明了其在结构重建和功能恢复方面的有效性，为基于hiPSC的临床级肌肉再生疗法迈出了关键一步。

应用价值： 该研究为治疗创伤、肿瘤切除等导致的严重肌肉缺损提供了潜在的“现成”组织工程产品蓝图。其模块化、可定制的制造理念，使得制造与患者特定缺损形状和大小相匹配的个性化植入物成为可能，具有重要的临床转化前景。

六、 研究亮点 1. 多层级仿生设计： 首次将hiPSC衍生的排列肌纤维、内皮化的可灌注血管网络以及仿生肌内膜支持基质三者一体化集成于单个可扩展的构建体中。 2. 干细胞友好型生物制造： uEMB技术优化了打印条件（温度、材料、交联），在保证打印精度的同时，维持了hiPSC的高活力和功能，解决了干细胞生物打印的难题。 3. 功能与机制并重： 研究不仅展示了VMLs在体内的良好再生效果，还通过系统的体外模拟和体内对照实验，深入揭示了血管化、旁分泌效应以及人源细胞贡献在功能恢复中的具体作用机制。 4. 跨模型验证： 在两种不同的免疫缺陷小鼠模型（NOD-scid IL2Rγammanull和人源化Rag2−/−γc−/−）中重复并验证了主要发现，增强了结论的可靠性和普适性。 5. 面向临床的可扩展性： 提出的模块化组装概念，为将来制造适用于大型动物乃至人类尺寸缺损的植入物提供了切实可行的技术路径。

七、 其他有价值内容 研究团队对技术的成熟度（Technology Readiness Level, TRL）进行了自评，认为目前达到了TRL 3水平（概念在相关环境，如体内得到验证）。他们指出了下一步迈向临床应用（TRL 4及以上）所需的工作：在更大动物模型（如猪）中测试模块化组装构建体的长期肌肉功能恢复能力，验证其在大尺寸缺损中的再生效能和全植入物范围内的细胞活性。这为后续研究指明了清晰的方向。